Применение денатурата в медицине

Прозрачная жидкость без посторонних частиц, без цвета или в зависимости от цвета красителя – синего или голубого с характерным запахом.

100 мл препарата содержит, (% по объему;): главную фракцию этилового спирта — (80±2)%, воду питьевую- до 100.

Денатурация, причины и признаки, использование в медицине.
Денатурат — не только яд, но и лекарственное средство
Применение денатурата в народной медицине
При ревматизме
При пяточной шпоре
При болях в коленях
Универсальная мазь
Денатурация, причины и признаки, использование в медицине.

Препарат имеет выраженное антимикробное и дезинфицирующее действие.

Внешне — в форме компрессов или линиментов, как дезинфицирующее, противовоспалительное, болеутоляющее средство при ударах, воспалениях кожи и подкожной клетчатки, воспалении мышц, суставов; для дезинфекции рук, операционного поля, кожи, инструментов и для изготовления ветеринарных препаратов исключительно для внешнего применения.

Яд. Применять внутренне запрещается.

Стеклянная бутылки по 300 мл и 500 мл, ПЭТФ-бутылки по 0,330 мл и 500 мл, стальные канистры или канистры из полимерных материалов по 1 л, 3 л, 5 л, 10 л, 20 л.

Хранят препарат в складских помещениях на расстоянии от нагревательных элементов не меньше 1 м, в плотно закрытой таре. Степень заполнения тары должна составлять не больше 90%. Температура хранения от +5°С до +25°С в сухом, защищенном от света месте.

Не допускается хранение препарата вместе с органическими кислотами (серной, азотной), сжиженными и сжатыми газами, легковоспламеняющимися веществами, с неорганическими солями, которые с органическими веществами образуют взрывоопасные смеси.

Источник: http://www.zoosite.com.ua/veterinary_preparation_1014.html

Денатурация, причины и признаки, использование в медицине.

Белки чувствительны к внешним воздействиям. Нарушение пространственной структуры белков называют денатурацией. При этом белок теряет все свои биологические и физико-химические свойства. Денатурация сопровождается разрывом связей, стабилизирующих "нативную" структуру белка. Как уже отмечалось выше, в основе стабилизации структуры белков основную роль играет слабое взаимодействие, поэтому денатурацию могут вызывать различные факторы: нагревание, облучение, механическое встряхивание, охлаждение, химическое воздействие. При денатурации, как правило, нарушается и растворимость белков, так как нарушение структуры приводит к появлению на поверхности большого числа гидрофобных групп, обычно упрятанных в центре белковой молекулы.

Первичная структура белка при денатурации не изменяется, что позволило показать возможность восстановления функций и структуры денатурированного белка, хотя в большинстве случаев денатурация является необратимым процессом. В лабораторной практике денатурация используется для депротеинизации биологических жидкостей. Факторы, вызывающие денатурацию, называют денатурирующими агентами. К ним можно отнести:

1. Нагревание и действие облучения высоких энергий (ультрафиолетовое, рентгеновское, нейтронное и т.д). В основе лежит возбуждение колебаний атомов, сопровождающееся разрывом связей.

2. Действие кислот и щелочей; изменяют диссоциацию групп, уменьшают число ионных связей.

3. Ионы тяжелых металлов. Образуют комплексные соединения с группами белка, что сопровождается разрывом слабого взаимодействия.

4. Восстановители — вызывают разрыв дисульфидных мостиков.

5. Мочевина, гуанидиний хлористый — формируют новые водородные связи и разрывают старые. Явление денатурации можно использовать и для качественного анализа присутствия белков в растворах. Для этого пользуются пробой с кипячением исследуемой жидкости после ее подкисления. Образующееся при этом помутнение связано с денатурацией белка. Часто используют и осаждение органическими кислотами: сульфосалициловой или трихлоруксусной.

Источник: http://studopedia.ru/17_105253_denaturatsiya-prichini-i-priznaki-ispolzovanie-v-meditsine.html

Насколько опасным (или безопасным) может быть использование денатурата в качестве наружного дезинфицирующего средства?

В данном случае речь идёт об этиловом спирте, в который добавлен метиловый, дабы его не пили несознательные граждане. Содержание этилового спирта 93 процента, метила (точнее это метил этил кетон). ну наверное до 3-5 процентов. Этих кетонов в природе до х и они как-то влияют на человеческий организм. С другой стороны, на емкостях с медицинскими дезинфицирующими жидкостями часто указывают, что там «алкоголь денатурированный» (чем?) и разные добавки. Кто-нибудь знает подробней?

Метилэтилкетон это не метиловый спирт.

LD50 (летальная доза при которой дохнет половина испытуемых животных) 6.86 мл/кг для крыс, то есть вещество не то чтобы очень токсичное (у алкоголя доза чуть больше но не сильно)

но сказано, что это вещество оказывает сильное раздражающее действие на дыхательные пути

НЕ СОВЕТУЮ. Зачем такой экстрим? Прополис — наше все.

Метилэтилкетон (C2H5-CO-CH3) — ближайший родственник диметилкетона (CH3-CO-CH3), который в просторечии именуется ацетоном.

Женщины лак с ногтей снимают, особо не раздражаясь.

Дезинфицировать и чистым ацетоном можно.

А 3-5% раствор с спирте.

Бредите? Почитайте про токсичность ацетона. А лучше протрите им рану. СЕБЕ.

Протирал (и обливал) неоднократно. Ацетоном, бензином, растворителями (646-м и далее по порядку), всем, что под рукой и способно растворить жир. Считаю, что в тех (производственных) условиях было полезнее это немедленно СДЕЛАТЬ, чем НЕ сделать.

Другой случай: загноившуюся мелкую рану засыпАл крупной солью, и такое было.

quote: Originally posted by ZavGar:

Метилэтилкетон (C2H5-CO-CH3) — ближайший родственник диметилкетона (CH3-CO-CH3)

А метанол ближайший родственик этанола гыгы

Надо оценивать по данным о токсичности.

Уже был здесь разговор о том, что метанол — не яд сам по себе.

Яд — формальдегид (формалин), который образуется непосредственно в органнизме человека под действием фермента.

quote: Originally posted by Карбофос:

Ладно. Моветон использовать ссылки на Вики, но почитайте:

Считается, что ацетон малотоксичен, также считается, что он не вызывает хронических болезней при использовании основных методов предосторожностей при работе с ним. Ацетон обладает возбуждающим и наркотическим действием, поражает центральную нервную систему, способен накапливаться в организме, в связи с чем токсическое действие зависит не только от его концентрации, но и от времени воздействия на организм. ЛД50 для мышей при вдыхании в течение 4-х часов — 44 г/м³. Для человека ЛД50 оценивается в 1,159 г/кг. ПДК 200 мг/м³.

Сколько в вашем организме накопится ацетона от протирания ваткой?

А если это 5%-ный раствор?

В крови в норме содержится 1-2 мг/100 мл ацетона, в суточном количестве мочи — 0,01-0,03 г. При нарушениях обмена веществ, например, при сахарном диабете, в моче и крови повышается содержание ацетона. Незначительная часть ацетона превращается в оксид углерода (IV), который выделяется с выдыхаемым воздухом. Некоторое количество ацетона выделяется из организма в неизменном виде с выдыхаемым воздухом и через кожу, а некоторое — с мочой.

quote: Originally posted by бригадир:

использование денатурата в качестве наружного дезинфицирующего средства?

За сим — умолкаю.

quote: Яд — формальдегид (формалин), который образуется непосредственно в органнизме человека под действием фермента.

Только не для работников моргов, где он используется как консервант. Через месяц уже не чувствуешь и не раздражает слизистые. Люди «с улицы» не могут находится в помещение для бальзамаций более нескольких минут, там где врач и санитар колдуют часами без противогазов. (конечно организм не говорит за это спасибо, но многие сотрудники доживают до 70+ лет).

quote: Originally posted by бригадир:

В данном случае речь идёт об этиловом спирте, в который добавлен метиловый

Для наружной дезинфекции (ватными шариками) место инъекции протирать — использовать можно, без проблем, конечно, если градусы позволяют.

Формалин — хромосомный яд. Раздражает он или нет.

quote: Формалин — хромосомный яд.

Да вроде дети у всех нормальные, и от онко никто не крякнул. Разве что алкоголизм некоторых «мучает» — не знаю, может это мутагенез такой

quote: многие сотрудники доживают до 70+ лет

Что поделаешь, хошь-не хошь, а бальзамируесся потихоньку в процессе работы

quote: Originally posted by Карбофос:

Метилэтилкетон это не метиловый спирт.

но сказано, что это вещество оказывает сильное раздражающее действие на дыхательные пути

Согласен, что мои познания в химии весьма скудные.

В данном случае, вышеупомянутая жидкость предназначена для бытового применения, поэтому указан и состав: этанол + метилэтилкетон со ссылками на CAS (исоответственно). В документации у этанола только один код, указывающий, что он легковоспламеняющийся. А у метилэтилкетона, кроме этого еще три кода: раздражение глаз, возможные повреждения кожи (при многократном воздействии) и отупение с головокружением (от паров).

Однако, на попадающихся мне упаковках жидкостей для медицинских целей (дезинфекция кожных покровов), состав входящего в них спирта не указан, упомянуто только, что это — денатурат. Так он таким же способом делается, или там какие-то другие компоненты?

надо чачу продавать. Если кто не в курсе — ей сперва покойников на Кавказе обмывают, а потом..продают урусам, шоб добро не пропало.

quote: Если кто не в курсе — ей сперва покойников на Кавказе обмывают, а потом..продают урусам, шоб добро не пропало.

Обмыть,потом собрать и продать. хлопотно в домашних условиях. Они же не замачивают тело в ванной с чачей, или в домах есть секционные столы с стоком.

Попадались прихожие которые просили воду после помывки покойного. их или посылали на юг или наливали с крана, в зависимости от настроения.

это другое. Секты, колдуны.

А ты знаешь, что если в Абхазии у кого-нибудь свадьба, сколько народу приходит? — вдруг спросил он. Я ещё не успел ничего сказать, а он уже продолжал:

-Если триста человек придет, то это считается очень мало. А если кто умер? Тоже не меньше трехсот придет! Пока изо всех аулов родственники, друзья, знакомые не простятся, не похоронят.

-Приятного тебе аппетита! А ты это к чему?

-А к тому, что когда кто-то умрет, его замачивают на некоторое время в корыте с чачей и после такой обработки покойник лежит себе спокойно ещё несколько дней. И что характерно, разлагаться не спешит.

-Та-ак, ну а чачу потом куда?

-Ха-ха! Да ты и сам уже всё понял! Если никто больше не преставится, то старухи чачу разливают по бутылкам и продают туристам.

-Мда-а. А с другой стороны пьют же люди корейскую водку со змеёй. А чем человек хуже змеюги? Эх, наливай! «

quote: -А к тому, что когда кто-то умрет, его замачивают на некоторое время в корыте с чачей и после такой обработки покойник лежит себе спокойно ещё несколько дней. И что характерно, разлагаться не спешит.

Человек гниёт изнутри, куда в данном случае чача не попадает. Если в холоде (+10 и ниже) то вполне реально, особенно пожилые. Ну а в тепле такая процедура до фени. Хотя в клим условиях Абхазии написанное возможно.

Кстати формалин именно белковый денатурирующий (дубильный) яд. Разрушает четвертичную структуру белка до вторичной.

ну, может, тело тогось. и унутрь накачивают)

А кто мне откроет страшную тайну или даже три?!

1. Сколько сейчас стоит динатурат за пол-литра. Пятилитровую канистру биотоплива для камина пытаются продавать за 1300 рублей, что несколько огорчает!

2. Можно ли без вреда для здоровья жечь классическую динатуру в помещении?

3. Если можно, то стоит ли добавлять немного сахара, чтобы динатура в топливной чаше биокамина не вспыхнула, а спокойно горела?

Ацетон уже палили, поэтому в ожидании Ваших ответов, полетел выгонять зеленовато-розовых камуфлированных чебурашек через люк ф паталке! ))

quote: Originally posted by ryzhov:

Я етот формалин как одеколон использовать могу. За двадцать лет в секционке его нанюхался наобливался. разве что не напился. И при вскрытиях (после промывания органокомплекса он ведь формалином заполняется), и при работе с гистологией, и при исследовательской работе (мы собачкам торакотомию делали, потом сначала физраствором интракардиально, а потом формалином, а потом в гисту и лаборанты готовят микропрепараты, а мы на них в мелкоскоп смотрим и умные статьи на благо родного медцентра пишем. Был я таким животным, аспирант называется. Работаешь без выходных за три цента. Днем в лабе, а ночью в неотложке дежуришь, из операционной только пописать и покурить).

Так вот, денатурат у нас продается в любой аптеке в качестве антисептика. Бывает еще 70% изопропанол. Если их не пить, то абсолютно спокойно наружное использование. Лаваж полостных ран я бы ими не делал.

quote: Originally posted by Erich Weisse:

стоит ли добавлять немного сахара, чтобы динатура в топливной чаше биокамина не вспыхнула, а спокойно горела?

С сахаром она не вспыхнет, она красиво взорвется. Сахар неплохой прекурсор взрывчатки. Сахар, вата, марганцовка, бензин, ацетон и азотная кислота у Вас бабахнут так, что мало не покажется. А если добавить олеума и крупицу платины (пропорций и молярных отношений специально не пишу), то при пороховом взрывателе рванет очень сильно. Ето именно компоненты биконпонованой взрывчатки.

Да простят меня офицеры спецслужб, читающих етот форум. Ничего секретного я не разгласил, пропорций не дал, и два компонента не перечислил.

Ага! И при всем этом сахар выступает как флегматизатор сгорания бензина в цилиндрах авто, согласно старой народной методике мести автовладельцам или изготовления фронтовых светильников из гильз и обрезков брезентовых ремней.

А взорвать можно и негорючие на первый взгляд натериалы, не смешивая их ни с чем особенным, только с окислителем. Это секрет Полишинеля, выстраданный многими поколениями производственников.

Сейчас «динка» редкость, цена (ориентировочно) — енот за литру, денатурирующие добавку вызывают сомнение в плане использования в домашних горелках. Но, согласитесь, платить 35 енотов за 5 литров биотоплива напряжно, вот и ищу безопасную замену. Подскажите пожалуйста, Октагон, сколько стоит жидкое топливо для биокаминов у Вас в Омерице за галлон?

Октагон, сколько стоит жидкое топливо для биокаминов у Вас в Омерице за галлон?

Около четырех. Я сам дом дизелем топлю, так что покупаюгалонов, а камины деревом, по старинке. За дерево я ничего не плачу.

А отапливаться чем-нибудь подешевле, чем солярка? Маслом отработанным, автоподача в топку щепы из халявного дерева и т.д.?

Спиртовый камин — самый натуральный и безгеморойный из эрзацкаминов. Существует масса вариантов исполнения вплоть до настольных и подвесных настенных, имитаций средневековых факелов и т.д.

А дровяной камин, да с массой заморочек, по-своему опасен, но позволяет приготовить в нем массу вкусных блюд ))

Мне переделка отопительной системы под другое топливо тысяч в тридцать обойдется. Две горелки, восемь зон, два бака по 600 галонов, насосы.

В моих каминах мы не готовим каждодневно, но они глубокие, примерно метр. Туда котелок засунуть или картошку испечь ничего не стоит. Картошку печем, супы делаем в старинном горшке. Мясо не делаю, ибо потом воняет. Я его на улице даже зимой делаю.

Но если камин достаточно велик и анатураж должен быть соответствующим — рыцарским: все-таки, с непременным запахом «верченого» мяса, цвайхандерами, моргенштернами и гобеленами на стенах, собаки вместо диспозера! ))

Ах, да! А для острастки лихих людей, завидующих тихому счастливому быту тружеников ланцета и клистира, добывать мясо в окружающих лесах исключительно акребузой на дымном порохе с пулькой с хороший грецкий орех! ))

Мечты, мечты! Искренне Вам завидую большой, белой, доброй, пушистой завистью!

Собака одна, но есть две кошки

Ну у нас кошки тоже обязаны справляться с собачачей работой по утилизации пищевых отходов. Благо в эпоху полуфабрикатов обрезков минимум, а кости скороспелой птицы очень мягкие. Иногда к кошачей кормушке и куницы приходят — когда дерутся, а когда и нет. Вот и вся живность. Иногда, правда, гуляя на окраине города и наслаждаясь природой можно встретить толстомордых зайчиков и кабанов, разъевшихся у людей на огородах, ну рыжих лис еще, но стрелять в городе нежелательно.

А вот с оружием для души у нас очень плохо : по некоторым позициям баснословно дорого, а по некоторым — просто не возможно ((

Оружия у меня достаточно, хоть огнестрельного, хоть холодного. Есть даже пушка.

Кошки у меня домашние, но толстых зайцев и лис из огорода гоняю. Оленей тоже. Стрелять их, нельзя, и куда они суки прячутся в охотничий сезон тоже не знаю.

Оне таки не идиеты то, зверюшки! Когда их стрелять нельзя — льнут к жилью и кажется, что живешь в зоопарке и, еще немного, и царская кунья шуба обеспечена. А как сезон — так крупные сразу рассредотачиваются подальше от жилья, а мелкие сцуко прячутся и быстро появляются только чтобы обокрасть кошачью кормушку или забытый во время разговора открытым багажник машины, вернувшейся из супермаркета! ))

Никогда не понимал владельцев-любителей современного армейского оружия, отслужившись и отстрелявшихся в свое время. Зачем? Неужели не хватило общения с сугубо утилитарными штампованно-сварными железяками? Скажите, Доктор, не в обиду никому будь сказано, это извращение сродни тяги к культуристкам, но с силиконовыми сисками?! Типо любофь настолько зла?! ))

quote: Никогда не понимал владельцев-любителей современного армейского оружия, отслужившись и отстрелявшихся в свое время. Зачем? Неужели не хватило общения с сугубо утилитарными штампованно-сварными железяками? Скажите, Доктор, не в обиду никому будь сказано, это извращение сродни тяги к культуристкам, но с силиконовыми сисками?! Типо любофь настолько зла?! ))

Угу. когда эта железяка тебе родней командира была, и без неё ты какашкой мог стать. а знаете как спать на калаше зимой приятно, сделав его прокладкой между спиной и ледяной стенкой земляночки. А еще им можно много чего полезного делать: открывать киловую тушонку, жарить на шомполе еду, крышкой коробки пользоваться как ложкой, лопаткой и ножом (заточив краешек), магазин при небольшой доработке за стакан сойдёт, а ремень вообще универсальное перевязо-подвязоное средство. да много чего. Хоть и не весело было но это один из предметов который скрашивал жизнь.

я свою сапёрку уже почти двадцать лет за собой в багаже по странам таскаю, привык. был бы АК дозволен в приобретение и транспортировке не задумываясь приобрёл бы.

Может это такая любоФь злая , скорее дружба.

quote: Originally posted by ryzhov:

магазин при небольшой доработке за стакан сойдёт,

Вот тут, коллега не соглашусь. Его хоть паяй, все равно течет, а если плашку наглухо запаять, что я скажу на осмотре оружия, когда пружины надо показывать?

С М16 та же беда, но там антабкой можно только бутылки с пивом открывать. Можно еще шпонкой продавливать пробки на бутылках с вином. А вот штык-нож для всего годится.

А вот М92 вещ универсальная. Тут можно и краешки магазинов заточить, и затвором банко открывать, и пяткой магазина пробки выбивать. Много, что можно, но ничего не сравнить с ТТ-33 или Кольтом-1911. Абсолютно универсальные инструменты.

Понимаю, но удивляюсь, как человек не чуждый умению исполнять и сочинять всякие такие армейские штучки и не считаю нужным тащить их в гражданскую жизнь, как удобные берцы и теплую техничку на бал )) всему есть свое время и место — даже такие великие солдафоны как Ржевскай и Наполеонтий Буанапартий все-таки периодически снимали шпоры, хотя бы для того, чтобы впав раж не ускакать слишком далеко со спущенными лосинами ))

Вот такый гемахт!

quote: Originally posted by Erich Weisse:

Ржевскай и Наполеонтий Буанапартий все-таки периодически снимали шпоры, хотя бы для того, чтобы впав раж не ускакать слишком далеко со спущенными лосинами ))

А вот ето хорошо!

Оружие, прости Г-споди, это святое! И не надо кащунствовать и изгаляться над любым стволом, даже ММГ — все должно заниматься своим делом с очень небольшими отклонениями. Только в околовоенных фильмах, вызывая воспоминания о кадете Биглере, шашками рубят всякую муйню как тяпкой, а на пиках куропаток жарят.

От лукавого это! ((

ММГ ето в лучшем случае кастет. Извините.

Лучше действующие кремневые дуельные пистолеты, чем ММГ ТТ. Кстати дуельные пистолеты у менй есть отменные. Настоящие, не новодел.

Теперь Вы точно не верите в педолегенду близких Дантесу мужчинок сочинивших о том, что от меткой Пушкинской пули его заслонила пуговица!

quote: Originally posted by oktagon:

Его хоть паяй, все равно течет, а если плашку наглухо запаять, что я скажу на осмотре оружия, когда пружины надо показывать?

металлические не пользовал, только пластиковый. герметиком выступил неожиданно завалявшийся в кармане рулончик лейкопластыря. Вынуть пружину с подавателем, нижнюю планку на место (главное. дабы в сале не была). матается хорошо и относительно герметично (потери в пределах разумного когда дармовое). пить со стороны большой кривизны выдержал три тоста на четверых до полного разъедания герметизирующих свойств пластыря.

Пользовал со товарищи по причине отсутствия любой посуды и наличия резко появившейся лишней «жидкости» в чужой бочке.

quote: Originally posted by ryzhov:

От лукавого это! ((

шпоры то снимали, но не выкидывали в мусор или не дарили своим адьюнтам. тихонько ставили в угол до времени будущих «вдохновений». оружие тоже на стене висит а не по карман или багажникам валяется.

Может и фотография на стене АК была бы уместней (как память о старом друге) но это точно что резиновая тётя..

а саперная лопатка на полевых выходах в миру ой как приятно облегчает приход к моменту отдыха..

Оружие призвано спасать родину и жизнь солдата, а как оно это сделает зависит от смекалки солдата. или надо дать позволить себе обломать зубы о железную банку тушонки небо что-то типа того.

В миру упаси господь пользовать висящего на стене «товарища» в не подобных вариантах, но вот моменты великой скорби?

quote: Originally posted by ryzhov:

металлические не пользовал, только пластиковый.

Металлический нам выдовали. И на АК, и на М16.

Тут сложно, могу описать с некоторыми ограничениями.

quote: Originally posted by oktagon:

Тут сложно, могу описать с некоторыми ограничениями.

Солдат и без ножа.

Хотя я лично (случалось) открывал консервные банки крестовой отверткой выворачивая с них одну из плоскостей ибо оголодавший я весьма зол. ))

А саперную лопатку мне с успехом заменяет еще советское мачете из НАЗ, правда, каюсь ибо сам грешен, впав в раж рубил 10 см, потом 20 см деревья, перерубив 30 см дерево понял, что растрескавшуюся 25 летнюю пластмассу на рукояти придется заменить, благо хвостовик хорош!

Но все, согласитесь, должно применяться по своему назначению и без эксцессов и останавливания танков жопой! ))

quote: Солдат и без ножа.

солдат со штык ножом..а это две разные вещи у меня на Ак-74 был не «курносый» штык с оранжевым пластиком а обоюдный 6х4 с тёмно коричневым, ломается как дети в школу при малейших поперечных нагрузках, точить его тоже устанешь..это была скорей декорация. А обычный нож солдату по уставу иногда не положен, когда на устав стало наплевать (в плане мат части) тогда и всё наладилось

quote: Originally posted by Erich Weisse:

Это и ежу понятно. Как там у казаков в письме турецкому султану

А что поделать )) если даже Царь-Батюшка нещадно разоружал казаков, отимая наиболее мощные инструменты, как, например, уточницы, ядрами из которых эффективно отбили франко-английскую агрессию в средине 19 века в Низовьях Дона. Но часть хороших вещей все-равно в народе осталась в середине 90-х нечаянно уточницой один дедочек катер на дно пустил — дробью.

Сам лично не участвовал, бо все это люди бают! ))

quote: Originally posted by Erich Weisse:

Но часть хороших вещей все-равно в народе осталась

ИМХО ето смекалка, которая как говорится из голи на выдумку хитра..

К теме топа. как пример множественные способы изьятия народом этанола из различных спиртосодержащих средств — от клёв и красок до паст для чистки обуви. Не от здравого разума конечно, но смысл похожий.

Уточница это типа малокалиберной пушки?

По сути — да! Калибр обычно первый или второй (по охотничей системе измерения), в основном — дульнозарядные, несмотря на наличие приклада с мягким затыльником, имеет обычно станок-треногу, на который цапфами передает возникающие при стрельбе усилия. Ствол гладкий предназначен для стрельбы дробью по стаям водоплавающей птицы, для уничтожения живой силы противника использовали картечь, плавсредства унучтожали пулями различных конструкций (включая разрывные), картечью в картузах, связанной. Будучи точно пристрелянными хозяевами, нанесли ужасные ранения живой силе и парализуюшие — технике (разрушение рубок, постов управления огнем и т.п.).

Источник: http://forum.guns.ru/forum_light_message/80/758144.html

Денатурат — не только яд, но и лекарственное средство

Денатурат или, по-другому, денатурированный спирт представляет собой смесь небольшого количества керосина, ментола и этилового спирта. Последний компонент берется за основу при приготовлении денатурата. Зачастую в эту смесь добавляют пиридин. Этот компонент придает денатурату характерный неприятный запах.

Что касается цвета, то его добиваются путем добавления фиолетового метилового красителя. Подобные меры позволяют предостеречь любителей выпить от употребления данной жидкости. Ведь денатурат, по сути, является ядом. Обычно данное вещество используют в качестве очищающего средства, растворителя, а также как горючее.

Применение денатурата в народной медицине

Денатурат часто используют в некоторых средствах нетрадиционной медицины, направленных в основном на лечение недугов, связанных с суставами. Чаще всего этот компонент можно видеть в препаратах против ревматизма. Стоит отметить, что денатурат применяют и в ветеринарии для дезинфекции кожи животных.

При ревматизме

1. Употреблять денатурат в больших количествах нельзя, так как это все же яд. Однако очень часто можно встретить рецепт от ревматизма. Многие специалисты утверждают, что избавится от этого недуга можно, если употреблять по 25 миллилитров денатурата в сутки.

2. А некоторые утверждают, сто от ревматизма нужно принимать всего 2 миллилитра в сутки данного вещества, предварительно разбавив его 100 миллилитрами холодной воды. Продолжительность подобной терапии составляет всего 18 дней. После этого нужно сделать перерыв на 18 дней, а затем повторить курс.

Пить его, конечно, очень сложно, так как денатурат обладает отвратительным запахом. В небольших количествах денатурат не дает осложнений после подобной терапии. Но при этом ревматизм полностью проходят, а суставы перестают болеть и хрустеть.

3. Существует еще один способ борьбы с ревматизма при помощи денатурата. Один стакан средства нужно вылить в разогретую сковороду и сесть над ней, обернувшись одеялом. Дышать испарениями денатурата нужно в течение 15 минут. Улучшение наступает уже после первой процедуры.

4. Также от ревматизма прекрасно поможет настойка, в составе которой имеется денатурат. Для ее приготовления нужно смешать стакан измельченных листьев каштана, стакан сока репейника и стакан денатурата. Такое средство нужно настаивать дней семь.

При пяточной шпоре

Денатурат в сочетании с другими компонентами помогает избавится от пяточной шпоры. Для приготовления препарата нужно 100 грамм денатурата, 100 грамм чеснока, желательно измельченного, 100 грамм семян каштана конского. Все компоненты нужно перемешать до образования однородной массы. Часть полученного состава необходимо выложить на салфетку, а затем приложить к больному месту. Подобный компресс следует держать в течение 15 минут. Проводить подобную процедуру нужно до 15 раз за сутки, прикладывая средство каждый час. Курс – от 10 до 15 суток.

При болях в коленях

Средства с денатуратом помогают избавится от боли в коленях. Для приготовления подобного препарата нужно смешать в одной емкости керосин и денатурат. Брать их нужно в равных пропорциях. В полученную смесь следует положить четыре стручка жгучего свежего перца.

Емкость со средством необходимо плотно закрыть и на месяц поставить в теплое место. Готовый состав нужно наносить на больные суставы трижды в сутки. Делать это нужно утром, ближе к обеду и перед отходом ко сну. Нужно набрать полную пригоршню средства и тщательно втереть его в больное колено.

Затем больной сустав нужно укутать шерстяной тканью до следующего втирания препарата. Подобную терапию нужно продолжать до тех пор, пока боли в коленных суставах полностью не исчезнут. Перед употребление этот народное средства нужно взбалтывать.

Универсальная мазь

На основе денатурата готовится необычайная мазь, которая помогает не только от радикулита, но и от простуды, а также от паралича. Однако если имеется заболевание почек, то втирать это средство в те места, где расположены эти органы запрещено.

Для приготовления препарата нужно взять 200 миллилитров самогона или же спирта, большой тюбик змеиного яда, чайную ложку бодяги, которую можно купить только в аптеке, пять стручков горького красного перца, 100 миллилитров подсолнечного масла, 100 миллилитров сока редьки черной, 100 миллилитров денатурата, 100 миллилитров скипидара.

Все компоненты нужно смешать в стеклянной посуде. Перец нужно вымыть и мелко порезать, а затем поместить в емкость со смесью. Состав нужно плотно закрыть и настаивать в темном месте около пяти дней. Спустя указанное время мазь будет готова.

Такой состав нужно нанести на больное место перед отходом ко сну. Также его нужно укутать. Наутро мазь стоит смыть теплой водой. Курс составляет 7 дней. После этого нужно сделать перерыв на месяц. При необходимости курс подобной терапии можно повторить.

Употреблять средства с денатуратом без консультации врача не стоит, так как данное вещество является ядом и при неправильном использовании может сильно навредить.

Источник: http://prozubstor.ru/raznoe-2/narodnye-sredstva/6177-denaturat-ne-tolko-jad-no-i-lekarstvennoe-sredstvo.html

Мне 75 лет. Поэтому очень хочется, чтобы люди воспользовались и моим жизненным опытом.

Началось все с того, что мой муж «проехал» на заднем месте целый лестничный марш. В результате у него на пояснице вздулась черная, словно смола, «подушка». Хирург порекомендовал достать денатурат и делать из него компрессы. После нескольких компрессов все встало на свои места.

Но не это главное, а то, что теперь мы только так и лечим всякие ушибы. И не только.

У девушки было под глазом затвердение. После трех компрессов из денатурата оно рассосалось. Рассосалось большое затвердение на груди и у женщины. Ей понадобилось для этого 4 компресса. Другая женщина двумя денатуратными компрессами (на низ живота) вылечила цистит, а еще другую женщину три компресса (на низ живота) избавили от кисты на яичнике. Старушка-диабетчица прикладывала компрессы на шишки от уколов. Двух компрессов оказалось достаточно. У женщины под ногтем был ужасный нарыв. Вылечилась компрессами из денатурата. Девушка потеряла голос. Помогли восстановить его три компресса на горло. Парню, чтобы избавиться от сучьего вымени, хватило четырех процедур, а артрит колена один больной вылечил пятью компрессами.

Один знакомый старик вылечил денатуратом язву желудка. Пил он его утром натощак с 50 г воды — первый день 5 капель, второй — 6 и т.д., пока не дошел до 20 капель за прием. После этого начал пить в обратном порядке, ежедневно уменьшая количество капель на одну, пока не дошел до стартовых 5 капель. После принятия час не ел и излечился навсегда.

У меня в центре века над глазом появилась болезненная припухлость. Утром не могла раскрыть глаз. Стала промывать его мочой, борной кислотой, мазать глазными мазями. Натянуло что-то вроде чирья. Тут я и вспомнила про денатурат. Смачивала в нем ватку, отжимала и прикладывала на 2-3 часа к больному месту, прикрыв полиэтиленовой пленкой. Вскоре боль и краснота прошли, а припухлость рассосалась. Конечно, во время этих процедур что-то попадало и в глаз, но от этого зрение стало еще лучше.

В молодости, когда жила в коммунальной квартире, то вышла на общую кухню и увидела, как старушка выпила 50 г чистого денатурата. На мой удивленный взгляд она ответила, что только, когда начала пить денатурат, ей стало легче. Тогда я не спросила от чего она его пила. Может быть, кто-то знает и напишет?

Компресс делать так. В двух частях теплой воды развести 1 часть денатурата, замочить толстую х/б тряпку, отжать и приложить к больному месту. Сверху прикрыть полиэтиленовой пленкой, чем-нибудь шерстяным, перевязать и оставить на ночь. Перед утром мокрый компресс снять, а теплую шерсть оставить. Тряпку хорошо промыть и высушить. Если будет раздражение, то помажьте слегка кожу стрептоцидовой мазью или присыпьте сухим порошком стрептоцида.

Денатурат продается в каждой ветеринарной аптеке.

А еще хочу рассказать про лечение остеомиелита и туберкулеза кости.

Девочка ушибла щиколотку на ноге. В том месте начал скапливаться гной и врачи все время его выкачивали. Так длилось 5 лет. Тогда один дедушка посоветовал вырвать во время цветения все растение мака вместе с кореньями, прокипятить его полчаса и в этом отваре парить ногу. Точно также нужно лечить туберкулез костей и ревматизм. Девочка выздоровела. Таким же образом в 1950 году вылечилась и моя тогда еще шестилетняя сестра, когда ей признали туберкулез кости. Хватило пяти процедур, чтобы она забыла об этой болезни на всю жизнь.

При воспалении уха нужно в ложке прогреть обыкновенное подсолнечное масло и теплым закапать.

Воспаление желчного пузыря лечится так. 6 капель березового дегтя растворить в половине стакана теплого молока или воды и выпить утром натощак за час до еды. Делать так два дня подряд, не больше. Березовый деготь можно купить в аптеке.

Лидия Петровна Плужник, 39600, г. Кременчуг, ул. Красина, 70, кв. 28

Источник: http://esculap.in/para-method/250-salt/798-pix-nigra.html

Денатурация, причины и признаки, использование в медицине.

Белки чувствительны к внешним воздействиям. Нарушение пространственной структуры белков называют денатурацией. При этом белок теряет все свои биологические и физико-химические свойства. Денатурация сопровождается разрывом связей, стабилизирующих «нативную» структуру белка. Как уже отмечалось выше, в основе стабилизации структуры белков основную роль играет слабое взаимодействие, поэтому денатурацию могут вызывать различные факторы: нагревание, облучение, механическое встряхивание, охлаждение, химическое воздействие. При денатурации, как правило, нарушается и растворимость белков, так как нарушение структуры приводит к появлению на поверхности большого числа гидрофобных групп, обычно упрятанных в центре белковой молекулы.

2. Действие кислот и щелочей; изменяют диссоциацию групп, уменьшают число ионных связей.

4. Восстановители — вызывают разрыв дисульфидных мостиков.

Ферменты. Особенности ферментативного катализа. Строение и структура ферментов.

Краткая история энзимологии.

Присуждением Нобелевской премии Дж Самнеру, Дж. Нортропу и Стенли в 1946 г была подведена черта длительному периоду развития энзимологии – науки о ферментах. Начало этой науки восходит к заре истории развития человечества, использующего ряд технологических ферментативных процессов в своей жизни: хлебопечение, виноделие, обработка шкур животных и т.д. Потребность совершенствования этих процессов стало побудительным началом для их углубленного исследования. К первым научным описаниям ферментативных процессов относится описание пищеварения у животных Рене Антуан реомюр (1683—1757) при постановке своих экспериментов исходил из сделанного Фолкнером предположения о том, что хищные птицы отрыгивают не переваренные остатки пищи. Реомюр сконструировал маленькую проволочную капсулу, в которую был положен кусок мяса и дал ее склевать сарычу. Через 24 часа птица выплюнула эту капсулу. В ней остался размягченный кусок пиши, который однако не портился. «Этот процесс может быть только результатом действия какого-то растворителя»,— заключил Реомюр. Лаззаро Спалланцани (), профессор истории естествознания в Университете города Падуя, сообщал о подобных же экспериментах. Однако он не рассматривал пищеварение как процесс ферментации по той простой причине, что при этом не образовывались пузырьки газа.

Позже процесс ферментации был более подробно изучен одним из основоположников современной химии Антуаном Лораном Лавуазье (). Изучая спиртовое брожение, происходящее при изготовлении вина, он обнаружил, что глюкоза превращается в спирт и углекислый газ,

К началу XIX в. преобладала общая точка зрения, что ферментация — это химические изменения, вызываемые некоторыми специальными формами органического материала, а именно «ферментами». В 1814 г. русский ученый (немец по происхождению) академик Петербургской Академии наук Константин Готлиб Сигизмунд Кирхгоф () показал, что образование сахара из крахмала в проросших зернах злаков обусловлено химическим процессом, а не появлением ростков. В 1810 г Ю. Гей-Люссак выделил основные конечные продукты жизнедеятельности дрожжей – спирт и углекислый газ. Я. Берцелиус, один из основоположников теории химического катализа и автор самого термина «катализ» в 1835 году подтверждает эти данные, отметив, что диастаза (экстракт из солода) катализирует гидролиз крахмала более эффективно, чем минеральная серная кислота. Важную роль в развитии энзимологии сыграл спор Ю Либиха с известным микробиологом Л. Пастером, который считал, что процессы ферментации могут происходить только в целой живой клетке. Ю. Либих, напротив, считал, что биологические процессы вызываются действием химических веществ, которые в последствии были названы ферментами. Термин энзим ( греч. еn– в,zyme- дрожжи) предложил 1878 г Фридрих Вильгельм Кюне чтобы подчеркнуть, что процесс идет в дрожжах в противоположность самим дрожжам, которые катализируют процесс ферментации. Однако в 1897 году Э. Бюхнер получил свободный от клеток экстракт из дрожжей, способный получать этанол и утвердил мнение Либиха.

Попытки объяснить одно из важных свойств ферментов специфичность привело в 1894 году немецкого химика и биохимика Э. Фишера к предложению модели взаимодействия фермента и субстрата, названной «ключ-замок» – геометрической комплементарности форм субстрата (ключ) и фермента(замок). В 1926 году Дж. Самнер после почти 9-летених исследований доказал белковую природу фермента уреазы. В те же годы Дж Нортроп и М Кунитц указали на прямую корреляцию между активностью кристаллических пепсина, трипсина и количеством белка в исследуемых образцах, приведя тем самым весомые доказательства белковой природы ферментов, хотя окончательные доказательства были получены после определение первичной структуры и искусственного синтеза ряда ферментов. Основные представления о ферментах получены уже во второй половине ХХ столетия. В 1963 году исследована аминокислотная последовательность РНКазы из поджелудочной железы. В 1965 г показана пространственная структура лизоцима. За последующие годы очищены тысячи ферментов и получено много новых данных о механизмах действия ферментов, их пространственной структуре, регуляции реакций, катализируемых ферментами. Обнаружена каталитическая активность у РНК (рибозимы). Получены антитела с ферментативной активностью –абзимы. Эта глава кратко знакомит с современными представлениями о строении, механизме действия и медицинских аспектах энзимологии.

Особенности ферментативного катализа.

1. Белковая природа катализатора

2. Исключительно высокая эффективность. Эффективность биологического катализа превышает эффективность неорганического в 12

3. Исключительно высокая специфичность:

а) абсолютная, когда фермент работает только со своим субстратом (фумараза с транс-изомерами фумаровой кислоты и не будет с цис-изомерами);

б) групповая — специфичен для узкой группы родственнных субстратов (ферменты ЖКТ).

4. Работает в мягких условиях (t=37, рН 7.0, определенные осмолярность и солевой состав).

5. Многоуровневая регуляция: регуляция активности на уровне условий среды, на уровне метаболона, на генетическом уровне, тканевом, клеточном, с помощью гормонов и медиаторов, а также с помощью субстратов и продуктов той реакции, которую они катализируют.

6. Кооперативность: ферменты способны организовывать ассоциации — продукт 1-го фермента, является субстратом для 2-го; продукт 2-го — субстратом для 3-го и т.д.

Кроме того, ферменты обладают адаптивностью, т. е. могут изменять свою активность и образовывать новые ассоциации.

7. Способны катализировать как прямую так и обратную реакцию. Направление реакции для многих ферментов определяется соотношением действующих масс.

8. Катализ жестко расписан, т. е. происходит поэтапно.

Специфичность действия ферментов.

Высокая специфичность ферментов обусловлена, конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурой активного центра фермента, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной или групповой специфичностью и с абсолютной специфичностью.

Для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Так например, пепсин, расщепляет белки животного и растительного происхождения, хотя они могут отличаться по химическому строению, а/к составу, физиологическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы и жиры. Это объясняется тем, что местом действия пепсина является пептидная связь. Для действия липазы таким местом является сложно-эфирная связь жиров.

Т. е. эти ферменты обладают относительной специфичностью.

Абсолютной специфичностью действия называют, способность фермента катализировать превращение только единственного субстрата и любые изменения в структуре субстрата делают его недоступным для действия фермента. Например: аргиназа, расщепляющая аргинин; уреаза, катализирующая распад мочевины.

Имеются доказательства существования стереохимической специфичности, обусловленной существованием оптически изомерных L- и D- форм или геометрических (цис- и транс-) изомеров

Так известны оксидазы L и D а/к.

Если какое-либо соединение существует в форме цис- и трансизомеров, то для каждой из этих форм, существует свой фермент. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-), но не действует на цис-изомер — малеиновую кислоту.

Ферменты как и белки делятся на две группы: простые и сложные.

Простые полностью и целиком состоят из а/к и при гидролизе образуют исключительно а/к. Их пространственная организация ограничена третичной структурой. Это в основном ферменты ЖКТ: пепсин, трипсин, лизоцим, фосфатаза.

Сложные ферменты кроме белковой части содержат и небелковый компонент (кофактор).

Эти небелковые компоненты отличаются по прочности связывания с белковой частью (апоферментом).

Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все ПП цепи оказываются связанными со своими небелковыми компонентами и не разделяются при выделении и очистке, то небелковый компонент называется простетической группой и рассматривается как интегральная часть молекулы фермента.

А под коферментом понимают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента, при диссоциации.

Между апоферментом и простетической группой существует ковалентная связь, довольно прочная.

Между апоферментом и коферментом существуют нековалентные связи (водородные или электростатического взаимодействия). Типичными представителями коферментов являются В1 (тиамин) — пирофосфат (он содержит В1); В2 (рибофлавин) — ФАД, ФМН (ОВР); РР — НАД, НАДФ (ОВР); Н (биотин) — биоцитин (карбоксилирование); В6 (пиридоксин) — пиридоксальфосфат; пантотеновая кислота — коэнзим А.

Многие двухвалентные металлы (Сu2+, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Мg2+, Ca2+) тоже выполняют роль кофакторов, хотя и не относятся ни к простетическим группам.

Металлы входят в состав активного центра или стабилизируют оптимальный вариант структуры активного центра.

гемоглобин, каталаза, пероксидаза

Кофакторную функцию могут выполнять также: HS-глутатион, АТФ, липоевая кислота, т-РНК.

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов, заключающуюся в том, что ни кофактор (кофермент или простетическая группа) ни апофермент в отдельности каталитической активностью не обладают и только их объединение в единое целое, протекающее в соответствии с программой их трехмерной организации, обеспечивает быстрое протекание химических реакций.

Полиферментные комплексы, метаболоны.

Метаболон – мультиферментный комплекс, состоящий из белков-ферментов обладающих всеми уровнями структурной организации и катализирующих отдельные метаболические пути. Эти комплексы обычно связаны с клеточными мембранами, играют важную роль в эволюции живых систем, поскольку обеспечивают высокую скорость катализа, тонкую, точную регуляцию и направленность (векторность) метаболизма во времени и пространстве.

В промежуточном метаболизме имеются мультиферментные комплексы, катализирующие сложную многостадийную реакцию окислительного декарбоксилирования 2-кетокислот и переноса образующегося ацильного остатка на кофермент А. В качестве акцептора электронов выступает НАД + . Кроме того, в реакции участвуют тиаминдифосфат, липоамид и ФАД. К дегидрогеназам кетокислот относятся: а) пируватдегидрогеназный комплекс (ПДГ, пируват→ацетил-КоА), б) 2-оксоглутаратдегидротеназный комплекс цитратного цикла (ОГД, 2-оксоглутарат→сукцинил-КоА) и в) участвующий в катаболизме разветвленных цепей валина, лейцина и изолейцина дегидрогеназный комплекс. Примером является ПДГ-комплекс.

А. Пируватдегидрогеназа: реакция

В пируватдегидрогеназной реакции участвуют три различных фермента [1-3]. Пируватдегидрогеназа (Е1) катализирует декарбоксилирование пирувата, перенос образованного гидроксиэтильного остатка на тиаминдифосфат(TPP, 1а), а также окисление гидроксиэтильной группы с образованием ацетильного остатка. Этот остаток и полученные восстановительные эквиваленты переносятся на липоамид (1б). Следующий фермент,дигидролипоамидацетилтрансфераза (Е2) переносит ацетильный остаток с липоамида накофермент А(2), при этом липоамид восстанавливается до дигидролипоамида. Последний снова окисляется до липоамида третьим ферментом,дигидролипоамиддегидрогеназой (Е3) с образованием НАДН + Н + (NADH + Н + ) (3). Электроны переносятся на растворимый НАД + черезФАДи каталитически активный дисульфидный мостик субъединицы Е3.

Пять разных коферментовэтой реакции различными способами ассоциированы с белковыми компонентами ферментов. Тиаминдифосфат нековалентно связан на Е1, Липоамид ковалентно связан с остатком лизина Е2, а ФАД прочно ассоциирован в видепростетической группы на Е3. НАД + (NAD + ) и кофермент А взаимодействуют с комплексом в виде растворимых коферментов.

Б. Пируватдегидрогеназный комплекс Escherichia coli

Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДГ-комплекс) бактерии Escherichia coli достаточно подробно исследован. Он имеет молекулярную массу от 5,3 · 10 6 Да и диаметр больше 30 нм, т. е. ПДГ-комплекс крупнее, чем рибосома. Комплекс состоит из 60 полипептидов (1,2): 24 молекулы Е2 (8 тримеров) образуют ядро комплекса кубической формы. Каждая из 6 граней этого куба занята димерами (возможно, тетрамерами) компонентов Е3, в то время как на 12 ребрах куба лежат димеры молекул Е1. Другие дегидрогеназы кетокислот построены аналогично, но могут отличаться числом субъединиц и молекулярной массой.

Пространственная организация составных частей комплекса очень важна для катализа. Кофермент, липоевая кислота, очень подвижен благодаря образованию связи с лизиновым остатком фермента Е2. «Ручка» липоамидадлиной примерно 1,4 нм в процессе катализа перемещается между E1 и Е3 (3). Липоамид таким способом может взаимодействовать как со связанным в Е1 тиаминдифосфатом, так и с растворимым коферментом А и акцептирующим электроны ФАД в Е3. Белковый домен ацетилтрансферазы, который связывает липоевую кислоту, очень гибок. Это дополнительно повышает дальность действия липоамидной «ручки».

Заведующий кафедрой биологической химии, д.м.н., проф.

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биологической химии

Обсуждено на заседании кафедры (МК или ЦУНМС)

ЛЕКЦИЯ по биологической химии

для студентов _2__ курсалечебногофакультета

Тема Ферменты 2. Механизм действия.

Учебные и воспитательные цели:

О механизме действия ферментов. Об этапах ферментативного катализа.

О факторах, определяющих активность ферментов [E], [S], [P], K_m. О влиянии pH, давления, температуры, ионной силы на активность ферментов.

Об изостерической и аллостерической регуляция.

Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 105–123; 1998. С. 143–156.

Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 52–92.

Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 76–110.

Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 100–111.

Ленинджер А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.

Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

1. Мультимедийная презентация.

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

Перечень учебных вопросов

Количество выделяемого времени в минутах

Механизм действия ферментов. Этапы ферментативного катализа.

Факторы, определяющие активность ферментов [E], [S], [P], K_m. Влияние pH, [P], tº, ионной силы на активность ферментов.

Изостерическая и аллостерическая регуляция.

Механизм действия ферментов. Этапы ферментативного катализа.

После установления химической природы фермента было подтверждено представление Михаэлиса и Ментен о том, что при энзиматическом катализе фермент соединяется с субстратом (они подходят как ключ к замку), образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продукта реакции.

Даниэль Кошланд предложил теорию «индуцированного» соответствия: т. е. что субстрат навязывает активному центру свою форму, а активный центр в свою очередь подгоняет форму субстрата под свою собственную.

Выдвинутая в 1913 году Л. Михаэлисом и М. Ментен общая теория ферментативного катализа постулировала, что фермент Е сначала обратимо и относительно быстро связывается с со своим субстратом S в реакции:

Образовавшийся при этом фермент-субстратный комплекс ES, не имеющий аналогий в органической химии и химическом катализе, затем распадается в второй более медленной (лимитирующей) стадии реакции:

1 этап: происходит сближение и ориентация субстрата относительно субстратного центра фермента и его постепенное «причаливание» к «якорной» площадке.

2 этап: напряжение и деформация: индуцированное соответствие — происходит присоединение субстрата, которое вызывает конформационные изменения в молекуле фермента приводящие к напряжению структуры активного центра и деформации связанного субстрата.

3 этап: непосредственный катализ.

Согласованные реакцииотличаются от 1 и 2 тем, что разрыв старых связей и образование новых происходитВ основе химических реакций лежит образование и разрыв химических связей

Все химические реакции сопровождаются, как правило, разрывом или образованием ковалентных связей. По характеру разрыва ковалентных связей различают три типа реакций

1. Гетеролитический разрыв связи: ковалентная связь разрывается таким образом, что электронная пара остается с одним из атомов, образующим связь. Атом при этом приобретает отрицательный заряд, а у второго атома возникает положительный заряд. Такие реакции называют также ионными. Гетеролитически разрываются полярные или легкополяризующиеся ковалентные связи. Реакция катализируется кислотами или основаниями;

Гомолитический разрыв связи: при разрыве ковалентной связи электронная пара разделяется между атомами с образованием свободных радикалов. Свободные радикалы — это атомы или группы атомов с неспаренным валентным электроном.

одновременно без образования радикалов или ионов

2. Нуклеофильные реагенты:богатые электронами соединения: а) отрицательно заряженные ионы, б) нейтральные молекулы, имеющие свободную неподеленную пару электронов, в) реагенты, способные давать карбанионы в ходе реакций. Нуклеофилы реагируют с органическими субстратами по их положительному реакционному центру. Легко образуют ковалентные связи. Биологически важными нуклеофилами являются аминогруппы, гидроксильные группы, имидазольные группы и сульфгидрильные группы аминокислот. Нуклеофильные формы этих групп одновременно являются основаниями. Связываясь с Н + ,- они основания, реагируя с другими электрондефицитными центрами – они нуклеофилы.

Электрофильные реагенты : Электрондефицитные соединения: а) положительно заряженные ионы; б) нейтральные молекулы с частично положительным зарядом на одном из атомов. Электрофилы реагируют с органическими субстратами по их отрицательному реакционному центру. Легко образуют ковалентные связи. Наиболее известными электрофилами в биохимических реакциях являются Н+, ионы металлов, углерод карбонильной группы.

Группы радикалов аминокислот – плохие электрофилы.

По числу молекулреакции можно разделить на мономолекулярные и бимолекулярные. В биологических системах реакции с большим числом участвующих молекул практически не встречаются.

По направлению реакций с учетом конечного результата можно выделить следующие типы реакций

1. Окислительно-восстановительные реакции включают потерю или присоединение электронов, в результате чего меняется степень окисления атомов, которые являются реакционными центрами. Многие окислительно- восстановительные реакции в клетке включают разрыв С-Н связи с отнятием у атома углерода двух электронов и переносе их на акцептор, роль которого могут выполнять коферменты. Конечный акцептор электронов у аэробных организмов кислород, представляющий бирадикал с двумя неспаренными электронами, Молекула кислорода поэтому может принимать только неспаренные электроны. Отнимаемые у субстрата пары электронов должны быть перенесены на кислород при помощи специальной электронпереносящей системы, включающей ряд переносчиков.

2. Реакции кислотно-основного взаимодействия. Взаимодействие между кислотами и основаниями с образованием солей

3. Реакции замещения. В ходе реакции происходит замена атомов или групп атомов на другие атомы или группы. Особое место среди реакций этой группы среди биохимических реакций занимают реакции переноса групп. Они включают перенос электрофильной группы от одного нуклеофила на другой. Такие реакции можно назвать реакциями нуклеофильного замещения. Наиболее часто переносимыми группами в биохимических реакциях являются ацильная, фосфатная и гликозильные группы. Примером такой реакции может быть гидролиз пептидной связи при помощи химотрипсина.

4. Реакции отщепления. Протекают одновременно по двум соседним атомам с отщеплением групп и образованием двойной связи. Отщепляемыми группами могут быть небольшие молекулы типа Н₂О,NН₃. Распад связи может проходить по одному из трех механизмов: а)согласованный механизм, б)постепенно с разрывом С-О связи и образованием карбокатиона, в) постепенно, с разрывом С-Н связи и образованием карбаниона. Ферменты катализируют отщепление воды двумя механизмами или протонированием ОН группы кислотой (кислотный катализ) или отщепление протона (основной катализ). Постепенное отщепление требует стабилизации образующихся заряженных групп противоположными по заряду группами (электростатический катализ). Одна из самых интересных реакций дихотомического процесса, катализируемая енолазой относится к этому типу реакций.

5. Реакции перегруппировки

изменяют форму углеродного скелета молекул. Среди метаболических реакций такой тип реакций встречается довольно часто. Например, реакции изомеризации. В результате реакции происходит перераспределение электронной плотности и характера связей.

Могут включать внутримолекулярный сдвиг водородного атома, таким образом, чтобы изменить расположение двойной связи. В таких реакциях протон отнимается у одного углеродного атома и переносится к другому. Наиболее распространенная реакция изомеризации — взаимное превращение альдоз в кетозы

Рацемизация — реакция изомеризации, в которой водородный атом изменяет свое стереохимическое положение в молекуле в хиральном центре. Эпимеризация то же самое, но молекула имеет несколько хиральных центров

6. Реакции, которые образуют или разрывают С-С связи. Это реакции, лежащие в основе и катаболизма и анаболизма. При превращении глюкозы в СО₂протекает 5 реакций разрыва С-С связей. Синтез глюкозы требует столько же реакций образования этих связей. Наиболее часто в этих реакциях принимает участие электрофильный карбонильный углеродный атом. Примерами могут быть реакции альдольной конденсации, катализируемые альдолазой, декарбоксилирование-кетокислот (изоцитратдегидрогеназная реакция) и др.

Факторы, определяющие активность ферментов [E], [S], [P], K_m. Влияние pH, [P], tº, ионной силы на активность ферментов.

У каждого фермента существует свой pH-оптимум. Существенное влияние на активность ферментов оказывает реакция среды. Для проявления их оптимального действия чаще всего существует узкий диапазон измерения pH среды (pH-оптимум). В некоторых случаях сдвиг pH на единицу снижает активность на 80%. Поэтому в экспериментальных условиях работы с ферментом очень важно поддерживать pH на постоянном уровне.

Слева приведены кривые зависимости активности фермента от изменения pH среды. Пепсин желудочного сока, который катализирует гидролиз белков, имеет pH-оптимум при pH=2. При pH=3 он теряет половину активности, а при pH=4 активность пепсина не измеряется. pH-оптимум амилазы, фермента, катализирующего расщепление крахмала, составляет 7,0. И в этом случае изменения pH на единицу приводит к снижению активности на 50%, а — на 2 единицы отмечается полная потеря активности. Относительно редко встречаются случаи, когда pH-оптимум активности ферментов находится в сильно кислой или щелочной среде. Это характерно для таких ферментов как пепсин и аргиназа (катализирует расщепление аргинина). Большинство белков при экстремальных значениях pH неустойчивы. рH-оптимум является важной характеристикой фермента, но ни как не исключительной, присущей только данному ферменту.

Табл 2-2.Значения pHопт. некоторых ферментов

Влияние температуры на активность фермента

Дело в том, что многие ферменты имеют схожие значения pH-оптимумов. Механизм влияния pH среды на активность ферментов заключается в том, что изменение этого показателя приводит к изменению степени ионизации амино- (NH₃) и карбосильных (СОО — ) групп в молекуле фермента. В результате белковая молекула фермента подвергается конформационным перестройкам, что сказывается на взаимоотношения между ферментом и субстратом.

Повышение температуры неоднозначно влияет на активность фермента

Ферментные реакции, как и любое химическое превращение, в значительной степени зависят от температурных условий. Старое правило о том, что повышение температуры на 10 0 С удваивает скорость химической реакции распространяется и на активность ферментов.

Так как все ферменты являются белками, а белки при температуре вышеС в большинстве своем необратимо изменяются, температурный интервал для работы ферментов ограничивается определенными пределами.. Активность фермента повышается при повышении температуры. Начиная с определенной температуры, совпадающей с началом денатурации белка, активность фермента падает. Следует учитывать, что стабильность отдельных ферментов при нагревании различна. Это обстоятельство находит практическое применение при выделении и очистке ферментов. В смеси ферментов с различной температурной чувствительностью можно измерить активность более устойчивого к нагреванию фермента, если предварительно нагреть смесь до температуры, разрушающей другие ферменты этой смеси. Используя это свойство, например, в клинической практике удается разделить разные изоферменты ЛДГ. Так специфический для сердца изофермент ЛДГ значительно менее чувствителен к нагреванию, чем другие изоферменты. Поэтому после нагревания реакционной смеси, остаточная активность ЛДГ отражает активность ЛДГ, в то время как ферменты, специфичные для мышц и печени при этом разрушаются, так как активность ферментов чувствительна к температуре, ферментативные реакции следует проводить при определенной температуре, обычно работают при температурах между 25 0 и 40 0 С.

Ферменты характеризуются высокой специфичностью

Специфичность — одно из удивительных свойств ферментов, обусловленное их белковой природой. Уже первые исследователи механизма действия ферментов отмечали это уникальное свойство ферментов, отличающее их от известных в то время катализаторов. Не вызывало сомнений и то что фермент действует не всей своей поверхностью, а свои функции выполняет при помощи отдельных участков этой поверхности. Участок молекулы фермента, обеспечивающий выполнение основных функций фермента получил название активного центра. Э. Фишер, пораженный этим свойством ферментов, предложил для объяснения специфичности взаимодействия фермента и субстрата модель «ключа и замка».

Эта модель предполагала существование такого центра как особой структуры и без связи с субстратом. Жесткие рамки взаимоотношений ключа и замка были дополнены моделью индуцированного взаимодействия, предложенной Д. Кошландом, моделью «рука-перчатка». Эта модель была подтверждена при помощи метода рентгеноструктурного анализа, позволившего построить пространственную модель фермента. Первым ферментом, пространственная структура которого была исследована этим методом, был лизоцим. Этот фермент катализировал расщепление полисахаридов стенки бактерий и некоторых грибов. Он был выделен из яиц, слюны и других биологических жидкостей. Лизоцим состоит из 129 аминокислот. В 1965 году Д.Филлипс расшифровал пространственную структуру лизоцима. Молекула представляла элипсоид вращения с размерами 30х30х45 ангстрем. В лизоциме были выявлены 5 -спиральных и три-структурных сегмента. Исследователи сразу обратили внимание на проходящую поперек молекулы глубокую расщелину, в которой помещались 6 моносахаридов субстрата. При этом 4 из 6 моносахаридов были комлементарны форме активного центра и хорошо размещались в активном центре, а для размещения двух моносахаридов потребовалось изменить их конформацию. В активном центре лизоцима были выявлены аминокислотные остатки, обеспечивающие связывание фермента и субстрата и аминокислотные остатки, обеспечивающие проведение реакции. В последующем такие исследования были проведены со многими ферментами, что позволило выявить в активном центре целый ряд функциональных групп или участков:

Способствующие группы– обеспечивают пространственную ориентацию субстратов уже при сближении фермента и субстрата, что позволяет субстрату взаимодействовать с активным центром фермента в наиболее благоприятной конформации.

Якорный или субстрат связывающий участок– обеспечивает наиболее адекватное и прочное связывание субстрата в активном центре фермента.

Химические связи, стабилизирующие пространственную структуру белков, природа применила и для взаимодействия фермента и его субстрата. К этим связям следует отнести прежде всего нековалентные связи и взаимодействия. Это

1. Силы Ван дер Ваальса

2. Электростатическое взаимодействие

3. Водородные связи

4. Гидрофобные взаимодействия

Каталитический участок- формируется группами , обеспечивающими проведение катализа

Вспомогательные группы– группы, повышающие реакционоспособность каталитического участка.

Якорный участок трипсина представлен длинным узким карманом с отрицательно заряженный Асп в глубине кармана. В этой карман легко проникают аминокислоты, имеющие длинную боковую цепь с положительным зарядом на конце; такими аминокислотами являются Лиз или Ар, которые хорошо связываются и распознаются, а гидролиз происходит на соседней пептидной связи.

В гидрофобном кармане, образованном радикалами Гли, Три и Лей химотрипсина располагается боковая цепь с ароматическим кольцом (Фен, Тир или Три)..

Пептидная связь образованная СООН группой ароматической аминокислоты устанавливается рядом с каталитическим участком химотрипсина.

Фермент эластаза подобен химотрипсину, но в эластазе, часть кармана блокирована парой объемистых валинов. Наиболее комплементарным этому карману может быть участок пептида содержащий Ала или Гли

Пространственная структура групп формирующих активный центр и является структурной основой специфичности. Специфичность у разных ферментов может проявляться по-разному.Ферменты как белки, построены изL-аминокислот и эта особенность придает ферментамстереохимическую специфичность. Такие ферменты взаимодействуют и катализируют превращения только одного из стерических или оптических изомеров субстрата. Например, одни оксидазы аминокислот избирательно действуют наL-аминокислоты, а другие только наD-аминокислоты. Помимо стереохимической специфичности многие ферменты обладают высокой избирательностью к типу химических групп субстратов. В большинстве случаев избирательность к группам – геометрическая специфичность – даже выше чем стереохимическая специфичность. Правда, лишь небольшая часть ферментов обладаетабсолютной специфичностью, т.е. катализирует превращение только одного субстрата. Чаще всего ферменты обладаютгрупповой специфичностью.Это означает, что они действуют на группу субстратов, предъявляя требования к типу группы и типу связи–абсолютная групповаяспецифичность или только к типу связи –относительная групповаяспецифичность. Нередко в объяснении типа специфичности используют термин предпочтение. Например, карбоксипептидаза А катализирует гидролиз всех С-концевых пептидных связей за исключением связей образованных Лиз, Арг или Про, если предшествующая аминокислота не Про. Обладая выраженной специфичностью к одному и тому же субстрату, ферменты могут отличаться по типу реакций, которые они катализируют. Например, глюкоза-6-фосфат – субстрат многих ферментов и глюкозо-6-фосфтазы и дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и др. Подобные взаимоотношения складываются у ферментов и с коферментами. Например, существуют дегидрогеназы, которые катализируют реакции окисления только при соединении с коферментом – нуклеотидом НАД + . С НАДФ + , который отличается только одной дополнительной фосфатной группой такие дегидрогеназы не взаимодействуют. И наоборот, есть дегидрогеназы, которые взаимодействуют только с НАДФ + . Некоторые ферменты не проявляют специфичности к типу связи, что нашло применение в лабораторной практике. Многие протеолитические ферменты катализируют гидролиз не только пептидных связей, но и эфирные связи. И если методически количественно трудно оценить скорость реакции гидролиза пептидных связей, то использование синтетических субстратов, представляющих эфиры аминокислот с красящимися веществами, позволяют быстро и просто оценить активность таких ферментов в клинической биохимической лаборатории.

Изостерическая и аллостерическая регуляция.

Регуляция активности ферментов бывает пассивная (с помощью изменения условий среды) т. е. есть постоянные ферменты и непостоянные, которые появляются под действием каких-либо факторов среды. (Под действием температуры или с помощью ионной силы и pH, [S], [E]).

(регуляция с помощью субстрата и продукта)

(регуляция активности фермента с помощью веществ, отличных от S и P).

Регуляция путем изменения количества фермента.

У бактерий хорошо изучен феномен индуцированного синтеза ферментов при выращивании на средах с одним углеводом, например, глюкозой. Замена глюкозы на лактозу приводит к индуцированному синтезу фермента галактозидазы, расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу.

В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается реже, однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцерогенных веществ, алкалоидов наблюдается резкое увеличение количества (а значит и активности) гидроксилаз, окисляющих чужеродные вещества в нетоксичные продукты. С другой стороны, иногда под действием этих гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в более токсичные продукты (летальный синтез).

Регуляция активности по принципу обратной связи.

Допустим в клетке есть многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Накопление продукта P оказывает мощное ингибирующее действие на фермент E1.

Аллостерические ферменты — это ферменты, располагающиеся в начале метаболического потока или на его узловых этапах и управляют этим метаболическим потоком.

Свойства аллостерических ферментов:

1. Являются олигомерами состоящими из протомеров.

2. Имеют как минимум два центра: активный центр и центр аллостерической регуляции.

3. Имеют ось симметрии.

4. Протомеры изменяют свою структуру в пределах олигомеров.

5. Изменение конформации олигомеров ограничено конформациями отдельных протомеров.

Существует 2 вида веществ (эффекторы), которые оказывают на фермент двоякое действие:

1) активаторы; 2) ингибиторы.

Аллостерический фермент имеет 2 центра аллостерической регуляции — центр аллостерической активации

— центр аллостерического ингибирования.

При взаимодействии аллостерического фермента с аллостерическим активатором резко возрастает степень сродства фермента к субстрату, точнее возрастает степень сродства активного центра к субстрату.

При взаимодействии аллостерического ингибитора с аллостерическим ферментом, резко понижается степень сродства фермента к субстрату.

Наличие двух центров в аллостерическом ферменте доказывается путем технической денатурации в мягких условиях (под действием мочевины) —> при этом аллостерический фермент теряет регуляторные свойства (они связаны с центрами аллостерической регуляции), но сохраняет каталитические свойства, связанные с активным центром.

Заведующий кафедрой биологической химии, д.м.н., проф.

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биологической химии

Обсуждено на заседании кафедры (МК или ЦУНМС)

ЛЕКЦИЯ по биологической химии

для студентов _2__ курсалечебногофакультета

Тема Ферменты 3. Регуляция активности.

Учебные и воспитательные цели:

О механизмах и роли аллостерической регуляции. Характеристике аллостерических ферментов. Видах ингибирования (обратимое, необратимое, конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное).

О регуляции активности ферментов путем химической модификации: Реакциях ограниченного протеолиза, аденилирования, рибозилирования, ацетилирования, фосфорилирования (роли гормонов, АЦ-комплекса, цАМФ, цГМФ, ионов Ca).

Об изоферментах, их природе, биологической роли, строении ЛДГ.

Об изменении активности ферментов в онтогенезе.

Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф.Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 126–132; 1998. С. 157–168.

Николаев А. Я.Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 52–92.

Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 63–75.

Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 105–144.

Врожденные и приобретенные энзимопатии / Под ред. Ташева Т. М.: Медицина, 1980.

Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981.

Руководство по клинической лабораторной диагностике. Киев: Вища школа, 1990. С. 167–186.

Зилва Ф., Пеннел Дж. Клиническая химия в диагностике и лечении. М.: Медицина, 1986. С. 372–388.

1. Мультимедийная презентация.

РАСЧЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

Перечень учебных вопросов

Количество выделяемого времени в минутах

Механизмы и роль аллостерической регуляции. Характеристика аллостерических ферментов. Виды ингибирования (обратимое, необратимое, конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное).

Регуляция активности ферментов путем химической модификации: Реакции ограниченного протеолиза, аденилирования, рибозилирования, ацетилирования, фосфорилирования (роль гормонов, АЦ-комплекса, цАМФ, цГМФ, ионов Ca).

Изоферменты, их природа, биологическая роль, строение ЛДГ.

Изменение активности ферментов в онтогенезе.

Кинетика многих ферментов не подчиняется принципам кинетики Михаэлиса и Ментен

При знакомстве с материалом по кинетике ферментов могло сложиться впечатление, что кинетика всех ферментов основана на принципах Михаэлиса и Ментен. Исключением было только влияние избытка субстрата. У ферментов, подчиняющимся принципам кинетики Михаэлиса и Ментен с позиций процессов, протекающих в клетке, имеется ряд недостатков. Для обеспечения нормальной жизнеспособности клетки требуется тонкая регуляция концентрации большинства метаболитов. Существует довольно узкий диапазон допустимых концентраций субстратов в клетке при потребности быстро реагировать изменениями скоростей реакции в широких пределах в ответ на постоянно меняющееся функциональное состояние клетки. Приведенный ранее расчет показывает, что скорости реакций мало чувствительны к изменениям концентрации субстрата. Например, повышение скорости от 0,1Vmaxдо 0.9Vmaxтребует повышения концентрации субстрата в 81 раз. Такие же цифры характеризуют и действие ингибиторов. Ферменты, управляющие превращениями метаболитов должны быть более чувствительны к изменению концентраций и субстрата и ингибитора. Таким образом, природа вынуждена обратиться к «кооперативным» системам, в которых маленькие изменения в одном параметре, например концентрации ингибитора, вызывают большие изменения в скорости. Графически результат работы такой кооперативной системы (график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата) выражается не гиперболой, аS-образной сигмоидной кривой (сигмоидальные кривые всегда сдвинуты вправо в сравнении с гиперболой). Существует большое семейство ферментов, которые представляют такие кооперативные системы. Это аллостерические ферменты.

Определение.Аллостерический белок определяется как белок, содержащий два или больше топологически различающихся центра связывания лигандов (субстраты, ингибиторы и т.д), которые функционально взаимодействуют друг с другом. Связывание лиганда, с одним центром изменяет свойства другого (их).

Большая часть аллостерических белков – аллостерические ферменты, но некоторые белки, типа гемоглобина, выполняют и другие функции.

Кооперативность Кооперативность — модификация константы связывания лиганда белком предшествующим связыванием другого лиганда. Константы связывания — подобны Ks для субстрата или Ki для ингибитора, являются в основном константами диссоциации белка и лиганда и указывает силу связывания, или сродство белка и лиганда. Км обычно принимается как константа связывания субстрата, поскольку ее проще измерять, чем Ks. Понятие кооперативность означает, что связывание одного лиганда к белку или увеличит или уменьшит способность белка, связывать вторую молекулу лиганда. Если модификация увеличивает способность связывания (или сродство), это называют положительной кооперативностью. Если способность связывания снижается — это отрицательная кооперативность. Два лиганда один из которых влияет на связывание другого, могут быть химически идентичны, например, одна молекула субстрата, изменяет связывание другой молекулы субстрата. Такое взаимодействие называют гомотропным эффектом. Если они химически различаются, например, влияние ингибитора на связывание субстрата, тогда это — гетеротропный эффект.

У аллостерических ферментов особые свойства

Аллостерические ферменты обладают рядом свойств, которые отличают их от не аллостерических. Следует подчеркнуть, что приведенные ниже свойства не обязательны для всех аллостерических белков. Это – общие особенности, по крайней мере некоторые из них проявляются у отдельных аллостерических белков.

Сигмоидная ( в отличие от гиперболической для не аллостерических) форма кривой зависимости скорости реакции от концентрация субстрата

Двухфазный ответ на конкурентные ингибиторы

Потеря аллостерических свойств при денатурации

Полимерная структура. Все аллостерические ферменты и белки имеют полимерную или четверичную структуру. Это значит, что типичный аллостерический белок будет состоять из ряда отдельных белковых цепей или субъединиц, которые связаны друг с другом слабыми взаимодействиями типа водородных связей и гидрофобного взаимодействия. Полимерная структура – ключевое свойство для функции аллостерического белка.

Не кооперативное связывание

Аллостерический фермент содержит ряд активных центров, в самом простом случае по одному на субъединицу, каждый из которых может связываться с лигандом. Взаимодействие между этими центрами и является основой кооперативности. Так, в типичном аллостерическом ферменте связывание молекулы лиганда к одному из активных центров инициирует изменение конформации, которое увеличит способность других активных центров связывать лиганды (положительная кооперативность. K₂ <<K₁) или понизит их сродство к лиганду (отрицательная кооперативностьK₁<<K₂). При отсутствии кооперативного взаимодействия -K₁=K₂.

Субъединицы связаны друг с другом слабым взаимодействием, поэтому аллостерический фермент будет часто существовать в растворе в равновесии между целым ферментом и индивидуальными субъединицами. При большом числе субъединиц могут возникать промежуточные формы между этими крайними формами, в которых будут связаны несколько субъединиц, но в меньшем количестве, чем в целом ферменте. В этом случае одиночная субъединица не может быть каталитически активна. Самая маленькая каталитически активная структура названа протомером. Связывание лигандов (субстрат, продукт или эффектор) к ферменту изменяет позицию равновесия между субъединицами. Сигмоидная кинетика.При составлении графика зависимости скорости от концентрации субстрата для ферментативной реакции для аллостерических ферментов получается несколько иной тип кривой, называемой сигм оидальной в отличие от гиперболической для не аллостерических ферментов. Ключевой элемент этой кривой, который отличает ее от гиперболической — «носок» у основания кривой , который можно видеть при низких концентрациях субстрата. В этой точке увеличение концентрации субстрата вызывает очень незначительное увеличение в скорости — диаграмма имеет очень небольшой наклон. При более высоких уровнях субстрата, (выше 0.5 единиц концентрации на этом графике) можно видеть, что увеличение концентрации субстрата начинает вызывать намного более значительное увеличение в скорости, и кривая становится более крутой. При высоких концентрациях субстрата график становится очень похожим на гиперболический график, и можно видеть такую же пологую кривую как и на графике уравнения Михаэлиса и Ментен.

Такой тип диаграммы характерен для положительной субстратной кооперативности. При очень низких концентрациях субстрата лишь небольшое количество активных центров фермента связываются с субстратом и фермент будет иметь низкое сродство к субстрату. Поэтому добавление большего количества субстрата вызывает только небольшое увеличение в скорости реакции, поскольку субстраты связываются очень плохо. Однако, по мере повышения числа связавшихся молекул субстрата, положительный кооперативный эффект увеличивает способность фермента связывать субстраты, и кривая на графике начинает это показывать, круто перемещаясь вверх. В конечном счете, точно так же как и в случае классической гиперболической кривой, ферменты постепенно насыщаются субстратом и линия делается пологой, показывая достижение максимальной скорости. Такой тип кривой не обязателен для всех аллостерических ферментов. В частности, многие ферменты катализируют превращение нескольких субстратов и исследования показывают, что такие ферменты могут проявлять положительную кооперативность (сигмоидальная кривая) для одного субстрата и катализировать реакцию по гиперболической кривой для другого.

Эффектор. Аллостерические ингибиторы и активаторы объединяют общим названием эффекторы. Эффектор — одна из важных особенностей аллостерических ферментов. Возможность изменять скорость реакции, катализируемой ферментом, ингибиторами и активаторами — краеугольный камень принципов регуляции метаболизма. Следующий график показывает пути, по которым эффекторы изменяют кинетический график типичного аллостерического фермента с положительной субстратной кооперативностью.

Ц ентральная линия графика — типичная сигмовидная кривая в отсутствии любого эффектора. В присутствии активатора (А) скорость реакции повышается при любой данной концентрации субстрата, в то время как ингибитор уменьшает скорость реакции. Интересны и изменения общей формы кривой по сравнению с центральной линией. Ингибитор увеличил сигмовидную форму, удлиняя «носок» кривой, в то время как активатор оказывал противоположный эффект. При более высокой концентрации активатора график в целом приобретает характер гиперболы. Это указывает на то, что аллостерический ингибитор увеличивает уровень субстратной кооперативности, в то время как активатор уменьшает его.

K-системы и V-системы Как видно из графика все линии стремятся к одному значениюVmax, но при этом эффектор влияет на связывание субстрата, что отмечено в изменении Км. Такая ситуация названаK-системой. Некоторые ферменты имеют эффекторы, которые изменяютVmax. Тогда говорят оV-системе..

Двухфазный ответ на конкурентные ингибиторы.Помимо взаимодействия с эффекторами, аллостерические ферменты являются объектом обычного конкурентного торможения, подобно любому другому ферменту. Классические конкурентные ингибиторы действуют, потому что они структурно подобны субстрату фермента. В аллостерическом ферменте, с положительной субстратной кооперативностью конкурентный ингибитор также достаточно близок по строению субстрату, мог бы иметь те же самые свойства кооперативности как и субстрат. В этом случае, низкая концентрация конкурентного ингибитора увеличивает способность фермента связывать молекулы субстрата, что фактически равно увеличению скорости реакции. При более высоких концентрациях ингибитора это блокировало бы связывание субстрата обычным способом, и реакция замедлится. Ингибитор тем самым оказывает двухфазный эффект. При низких концентрациях — он действует как активатор, в то время как при высоких концентрациях, он действует как ингибитор.

Денатурирующие агенты. Денатурация – нарушение пространственной структуры фермента с последующей потерей активности фермента. Денатурация вызывается рядом факторов, включая высокую температуру, экстремальные значения рН и химические денатурирующие реактивы типа мочевины.

Аллостерические ферменты, подвергнутые умеренному воздействию одним из этих факторов денатурации часто вначале теряют свои аллостеричесие свойства (субстратную кооперативность) при сохранении способности катализировать реакции. Это хорошее доказательство того, что третичная структура играет ведущую роль не только для механизмов катализа, но для механизмов аллостерической регуляции.

Две модели объясняют механизмы аллостерии.

Предложены две основные модели, описывающие механизмы аллостерии: согласованный механизм аллостерических взаимодействий или симметричная модель, предложенная Жаком Моно, Джефри Уайменом и Жаном-Пьером Шанже в 1965 году , и последовательная модель, предложенная Даниелом Кошландом. В основном эти модели лишь крайние формы представлений о механизме работы аллостеричеких ферментов.. Главное различие между ними в том, что симметричная модель представляет мультимерный аллостерический фермент как объединение нескольких субъединиц, согласованно изменяющих свою конформацию, в то время как модель Кошланда учитывает сосуществование смешанных, или гибридных молекул, субъединицы которых могут находится в различных конформационных состояниях.

Симметричная модель. Симметричная модель аллостерии является простым и изящным объяснением положительной субстратной кооперативности и влияния аллостерических эффекторов. Она основана на идее, что аллостерический фермент состоит из ряда субъединиц, которые могут существовать в двух различных конформациях. Их обозначают как расслабленное илиR-состояние, и напряженное илиT-состояние.

В се субъединицы данной молекулы фермента должны иметь одну и ту же конформацию. Другими словами, молекула фермента должна состоять полностью изRсубъединиц илиTсубъединиц, и не может содержать смесь этих форм. В растворе эти две формы находятся в равновесии. Поскольку смесей типов субъединиц в индивидуальном белке невозможны, в растворе возникает простое равновесие между белками, состоящими полностью изRиTсубъединиц.

Для объяснения работы модели нужно сделать еще два предположения:

Во-первых в растворе и в отсутствии любых лигандов (субстрата или аллостерического эффектора) равновесие сдвинуто в сторону T-формы.

Во-вторых, конформация активных центров такова, что R-состояние имеет более высокое сродство к лиганду. Это не обязательно означает, чтоTформа неспособна к связыванию лиганда, просто у нее более низкое сродство.

Е сли добавляется небольшое количество лиганда к этому раствору, более вероятно, что он свяжется сRбелком, поскольку тот имеет более высокое сродство. Это приведет к образованию комплекса, в котором белокRсо связанной молекулой лиганда, утратит способность переходить в Т форму, что сместит сложившееся равновесие вправо, увеличив числоRбелков с высоким сродством к лиганду и увеличив тем самым общее сродство к лиганду в системе. Результат — положительная кооперативность — связывание одной молекулы лиганда а увеличивает способность белка, связывать другие молекулы лигандов.

А ллостерические эффекторы.Влияние эффекторов на ферменты можно объяснить просто, добавив к сказанному выше, что у фермента есть два центра связывания лигандов. Роль одного лиганда будет выполнять субстрат, взаимодействующий с активным центром, а второй лиганд – эффектор, связывающийся со специальным аллостерическим центром. Субъединицы фермента также могут принимать илиRилиTконформации. Активатор хорошо связывается с ферментом, который находится вR-конформации, обладающей одновременно высоким сродством к субстрату. Связывание активатора смещает равновесие в сторонуRконформации с высоким сродством к субстрату, что способствует повышению скорости реакции.(«носок» на сигмовидной кривой). Чем выше концентрация активатора, тем выше скорость реакции и тем более похожей на гиперболу становится график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (сглаживание «носка» на кривой), и при больших количествах активатора на графике возникает гипербола. Эффектор со свойствами ингибитора имеет более высокое сродство кT-конформации. Его присоединение смещает равновесие в противоположном направлении, к появлению в растворе ферментов с низким сродством к субстрату и уплощению и удлинению «носка» на графике .

Симметричная модель объясняет свойства аллостерических ферментов простым и изящным способом, однако свойства некоторых ферментов лучше объясняются последовательной моделью.

Последовательная модель. Симметричная модель была основана на условии, что одна молекула фермента содержит только один тип субъединиц -RилиT. Последовательная гипотеза обращается к возможности существования смешанных ферментов , содержащих оба типа. Равновесие лишь достигается в растворе, в котором законченныеRиTструктуры просто представляют экстремальные значения:

В основе связывания субстрата — индуцированное взаимодействие.

Последовательная модель принимает, что субстрат оказывает более прямое влияние на форму фермента. В отсутствии субстрата фермент существовал бы более или менее полностью в T-форме, которая имеет очень низкое сродство к субстрату. Так как субстрат входит в активный центр, как обычно путем случайного столкновения, отдельные части молекулы белка фермента самостоятельно обхватывают субстрат, обеспечивая хорошее взаимодействие. Это известно как индуцированное взаимодействие. Процесс индуцированного взаимодействия способствует переходу субъединицы, с которой связался субстрат вR-конформацию.

Изменение конформации одной субъединицы индуцирует изменения структуры другой

Одна субъединица теперь была преобразована в R-форму, но другие — все еще вT-состоянии. Отметим, что эти субъединицы связаны друг с другом и взаимодействуют друг с другом. Если мы принимаем, что переход одной субъединицы изTсостояния вRоказывает влияние на переход в состояниеRдругих субъединиц, мы говорим о положительной кооперативности в действии субстрата, поскольку большее количество субъединиц, вероятно, перейдет в состояние с более высоким сродством к субстрату. Это изменение для других субъединиц может происходить до связывания субстрата или просто облегчать индуцированное взаимодействие при приближении молекулы субстрата.

Ингибиторы и активаторы. Влияние аллостерических эффекторов можно также легко объяснить. Активатор подобен в своем действию субстрату только уже при связывании с другим центром на субъединице, в то время как ингибитор будет делать фермент более жестким, и затрудняет индуцированое взаимодействие при переходе от Т доR.

Отрицательная субстратная кооперативность. Отрицательная субстратная кооперативность встречается не часто, но это происходит у некоторых ферментов. Симметричная модель не может объяснить отрицательную субстратную кооперативность, так как на основе закона действующих масс трудно объяснить перемещениеRTравновесия в сторону высокого сродства. Последовательная модель объясняет это совершенно легко. Нужно только принять, что взаимодействие между субъединицами — таково, что преобразование одной из них вR-форму вызванную индуцированным взаимодействием делает это более трудным для других субъединиц.

Какая гипотеза является правильной?

Существование отрицательной кооперативности дает право предположить, что последовательная гипотеза более реальна. С другой стороны существование смесей Т и Rсубъединиц ведет к намного более сложному равновесию. Некоторые исследования, используя быстрые методы измерения скорости реакции, предполагают, что функция некоторых ферментов лучше объясняется с позиций симметричной модели. В некоторой мере гипотеза симметрии может быть рассмотрена как частный случай последовательной, в которомT/Rкомбинации могут существовать лишь на протяжении очень короткого времени.

Ингибиторы бывают разные: обратимые и необратимые

Вещества со свойствами ингибиторов ферментов можно грубо разделить на обратимые и необратимые. Обратимые ингибиторы связываются с ферментом, используя слабые связи, подобные тем, которые используются ферментом в связывании субстрата. Эти связи формируются быстро, но также быстро и легко разрушаются. Следствием такого связывания обратимого ингибитора является эффективное мгновенное действие, но после удаления ингибитора фермент сохраняет свою активность. Ингибитор находится в равновесии с ферментом, формируя комплекс ингибитора фермента:

С тепень торможения зависит от количества фермента, связавшегося с ингибитором, т.е. от позиции равновесия.

Н еобратимые ингибиторы известны также как инактиваторы фермента. Они связываются с ферментом, формируя прочные, обычно ковалентные связи:

Реакция практически необратима и фермент теряет свою активность. Учитывая, что ковалентные связи образуются медленнее, для проявления действия необратимого ингибитора требуется некоторое время для взаимодействия с ферментом. Следовательно, действие необратимого ингибитора обычно зависит от времени и степень торможения увеличивается со временем контакта его с ферментом.

Многие необратимые ингибиторы нашли применение в исследовании ферментов и медицине.

Среди примеров необратимо действующих ингибиторов можно назвать диизопропилфторфосфат (ДИПФФ). Это соединение вошло в историю энзимологии как соединение использовавшееся для исследования роли химических групп в в структуре активного центра. ДИПФФ ковалентно связывается с гидроксильной группой серина и если эта группа важна в катализе реакции, фермент терял свою активность. Эти исследования позволило выявить группу ферментов, в активном центре которых активную роль играет серин (сериновые протеазы)

Другое соединение иодацетамид, образует ковалентную связь с SH–группами цистеина и если эта аминокислота важна для активности фермента, такой фермент утрачивает активность.

Ацетилсалициловая кислота (известный всем аспирин) является необратимым ингибитором циклооксигеназы- фермента участвующего в синтезе простагландинов. Ингибитором синтеза протеогликанов стенки бактерий является пенилиллин, структура которого напоминает D-аланин, встраиваемый в структуру протеогликанов. Связываясь с активным центром фермента бактерии благодаря своей схожести с переходным состоянием промежуточного продукта в активном центре, пенициллин образует ковалентную связь и тормозит работу фермента.

Обратимые ингибиторы могут быть конкурентными и неконкурентными

Различия между этими типами обратимых ингибиторов касаются их взаимоотношений с субстратом. Если ингибитор конкурирует с субстратом за место связывания на ферменте и действие одного может быть отменено избытком другого, говорят о конкурентном торможении, в противном случае речь идет о неконкурентных ингибиторах.

Конкурентные ингибиторы не всегда структурно подобны субстрату.

Различают два механизма конкурентного торможения.

А.Конкурентное торможение путем связывания активного центра. Классический конкурентный ингибитор — вещество, которое имеет структурное сходство с субстратом фермента. Благодаря этому подобию ингибитор может связываться с активным центром вместо субстрата. Это своеобразная молекулярная ошибка. Однако, поскольку субстрат и ингибитор не идентичны полностью, фермент не способен катализировать превращение ингибитора в продукт. Ингибитор просто блокирует активный центр фермента. Если субстрат свяжется с активным центром раньше, чем ингибитор, ингибитор не может связаться с ферментом. Нельзя одновременно обоим связаться с активным центром. Такой способ конкурентного торможения получил название изостерического из-за схожести (изос) структур субстрата и ингибитора. Наиболее часто в клетке в роли классического конкурентного ингибитора выступает продукт данной реакции, что имеет глубокий практический смысл.

Б. Конкурентное торможение путем изменения конформации фермента. В отличие от классического варианта, ингибитор связывается не с активным центром, а со специальным центром, связывающим ингибитор, который расположен вдали от активного центра. Связывание ингибитора вызывает изменение пространственной структуры (изменение конформации) в области активного центра, которое не позволяет присоединиться субстрату. Предшествующее связывание субстрата к активному центру в свою очередь, вызывает изменения конформации центра связывания ингибитора, которое предотвращает связывание ингибитора. И субстрат и ингибитор не могут одновременно связаться с ферментом. В этом виде конкурентного торможения ингибитор может иметь любую химическую структуру, поскольку они связываются с различными участками фермента.

Конкурентные ингибиторы не влияют на Vmax, они понижают Км.

Реакции связывания и субстрата и конкурентного ингибитора протекают быстро и обратимы, так что они существуют в равновесии. Позиции этого равновесия будут зависеть от концентраций реагентов. Учитывая, что фермент участник обеих реакций их равновесн ые состояния взаимосвязаны. Это означает, что при высоких уровнях ингибитора фактически все молекулы фермента будут участвовать в образованииEIкомплекса, и фермент будет почти полностью ингибирован. С другой стороны, при высоких концентрациях субстрата почти все молекулы фермента будут связаны вESкомплексе и ингибитор не сможет связаться с ферментом. Высокие концентрации субстрата снимают действие ингибитора. Субстрат и ингибитор конкурируют друг с другом.

График Лаинуивера-Берка в случае классического конкурентного ингибирования

Эффект на K_mКм — индикатор сродства субстрата и фермента. В присутствии конкурентного ингибитора некоторые молекулы фермента будут существовать как свободные ферменты, другие как комплексы ингибитора фермента. Первые будут иметь нормальное сродство, а вторые полностью неспособны к связыванию субстрата. Км измеряет полное сродство фермента в реагирующей смеси, которое будет представлять среднее значение между нормой и нулевым значением этого сродства, и поэтому будет явно меньше нормального значения. Так что конкурентный ингибитор уменьшает сродство субстрата и фермента, или увеличивает Км.

Эффект на V_max Vmax — скорость при высоких концентрациях субстрата. Поскольку в этих условиях, ингибитор вытесняется субстратом, он не тормозит фермент вообще и, следовательно, конкурентные ингибиторы не замедляют реакцию при высоких концентрациях субстрата, и не изменяют Vmax. Это можно хорошо видеть на графике Лайнуивера-Берка. Наклон графика равенKm/Vmax. Увеличение наклона в присутствии ингибитора указывает на снижение скорости реакции при низких уровнях субстрата.

Наиболее часто приводимый пример конкурентного ингибирования — это использование малоновой кислоты для торможение дегидрогеназы янтарной кислоты. Наиболее близким структурным аналогом сукцината является малоновая кислота.

Примеры конкурентных ингибиторов.

Малоновая кислота тормозит активность дегидрогеназы янтарной кислоты, занимая активный центр на ферменте. Учитывая обратимость реакции, избыток янтарной кислоты снимет действие малоновой кислоты.

Принципы конкурентного торможения находят применение в медицинской практике.

Н апример, этиловый спирт используется с лечебной целью как конкурентный ингибитор для лечения отравлений этиленгликолем или метиловым спиртом. В обоих случаях проблема часто возникает среди алкоголиков, потребляющих эти алкоголи как дешевый заменитель этанола. Однако, имеются другие ситуации, где может возникать такое отравление. Производители вина добавляют этиленгликоль к своим винам, чтобы придать им внешний вид более дорогих вин. В результате большое количество ничего не подозревающих людей могут потреблять это токсическое соединение. Эти соединения часто потребляются случайно взрослыми и детьми. Животные, главным образом собаки и коты, иногда вылизывают пролитый антифриз из-за его особого вкуса.

В таких случаях этиловый спирт — не яд, а продукт метаболизма. Алкогольдегидрогеназа катализирует образование соответствующего альдегида, который затем превращается в кислоту альдегиддегидрогеназой. Результатом этого процесса является образование формальдегида и муравьиной кислоты из метанола и глиоксаля и щавелевой кислоты из этиленгликоля. Альдегиды – основные токсические вещества , но и кислоты тоже дают нежеланные эффекты. Прежде всего, они могут вызывать ацидоз. Щавелевая кислота может кристаллизоваться в форме соли кальция в почечных канальцах, вызывая механическое повреждение.

Если затормозить эти реакции, метанол и/или этиленгликоль будут выделяться неизменяемыми. В ряде случаев это можно сделать, применяя конкурентный ингибитор. Этиловый спирт — такой ингибитор. Сродство алкогольдегидрогеназы к этиловому спирту примерно в 160 раз выше, чем к этиленгликолю. Задача врача поднять уровень этилового спирта в крови до 0.1 мг/l00 мл, что приведет к вытеснению этиленгликоля из реакции и выведению этиленгликоля с мочой.

С мешанные неконкурентные ингибиторы

Неконкурентный ингибитор связываясь со специальным центром на ферменте, расположенным вдали от активного центра, вызывает конформационные изменения в активном центре. Это несколько напоминает один из типов конкурентных ингибиторов, но в отличие от этого механизма изменения конформации активного центра не препятствуют связыванию субстрата а тормозит проведение реакции и образование продукта..

Классический неконкурентный ингибитор не оказывает влияния на связывание субстрата. Изменения формы активного центра незначительны, хотя сродство к субстрату все же снижается. Такие ингибиторы часто называются смешанными ингибиторами, поскольку они проявляют свойства конкурентных и неконкурентных типов. Фактически классические неконкурентные ингибиторы встречаются очень редко.

Кинетика смешанных неконкурентных ингибиторов

Фермент может связываться и с субстратом и с ингибитором с образованием комплексов:

Однако в отличие от конкурентного торможения и субстрат ингибитор способны одновременно связываться с ферментом, образуя тройные комплексы:

Т акой комплекс не способен катализировать реакцию.

О братите внимание, что комплексEISможет возникать двумя путями, но конечный результат один и тот же — образуется неактивный фермент. Ингибитор может работать одинаково хорошо при низких концентрациях субстрата, когда большая часть молекул фермента находится в форме свободного фермента, и при высоких концентрациях субстрата, когда фермент находится в формеESкомплекса, поскольку ингибитор связывается одинаково хорошо с обоими из них.

Влияние на K_m Классический смешанный неконкурентный ингибитор не оказывает влияния на связывание субстрата, сродство фермента к субстрату и следовательно не влияет на Км.

Смешанный ингибитор позволяет субстрату связываться, но снижает его сродство, так что Км повышается.

График Лаинуивера-Берка для неконкурентного классического(слева) и смешанного типов ингибиторов

Влияние на V_max Неконкурентные и классический и смешанный варианты, тормозят активность при высоких концентрациях субстрата, так чтоVmaxснижается.

Г рафик Лайнуивера-Берка для типичного классического смешанного неконкурентного ингибитора и для смешанного неконкурентного. На графике для смешанного конкурентного ингибитора две линии по разному пересекают 1/ [S], указывая на увеличение Км, хотя на графике для классического смешанного неконкурентного ингибитора, значенияKmидентичны. Однако оба графика показывают увеличение наклона в пересечении на оси 1/V, демонстрируя, что ингибитор является эффективным при высоких и низких концентрациях фермента.

Заключение. Смешанные неконкурентные ингибиторы связываются с центром, который является отдаленным от активного центра. Они тормозят активность фермента, вызывая изменения конформации , препятствующие превращению субстрата в продукт. Субстрат и ингибитор способны к связыванию с ферментом одновременно, образуя тройной комплекс. Это означает, что ингибитор не конкурирует с субстратом при высоких концентрациях субстрата и работает одинаково хорошо и при низких и высоких концентрациях субстрата. Правда способность связываться (сродство) с комплексом ингибитор+фермент у субстрата может снижаться, хотя на практике нет особых различий между так называемым смешанным ингибитором и классическим неконкурентным ингибитором.

Неконкурентные ингибиторы не могут связаться со свободным ферментом.

Понятие неконкурентный ингибитор часто смешивают с понятием смешанный неконкурентный ингибитор! Ингибиторы такого типа встречаются редко, хотя они имеют прямое отношение к изучению мультисубстратных ферментов.

Главная особенность этих ингибиторов — они не способны связываться со свободным ферментом. Они связываются только с фермент-субстратным комплексом. Это объясняется тем, что субстрат сам непосредственно включен в связывание ингибитора или связывание субстрата вызывает изменение конформации в связывающем ингибитор центре, облегчающее связывание ингибитора. Связывание ингибитора вызывает торможение активности фермента и превращение субстрата в продукт. Это может быть следствием прямого взаимодействия, или изменения конформации активного центра.

Неконкурентных ингибиторы неактивны при низких концентрациях субстрата.

Д ля связывания неконкурентного ингибитора, фермент должен сначала связаться с субстратом:

и только затем происходит связывание с ингибитором:

К омбинация ингибитора со свободным ферментом:

Это означает, что неконкурентные ингибиторы неактивны при очень низких концентрациях субстрата, когда почти весь фермент присутствует в свободной форме. При высоких концентрациях субстрата, когда большая часть молекул фермента присутствует в форме комплекса с субстратом, ингибитор эффективен.

Влияние на K_m Неконкурентные ингибиторы оказывают довольно неожиданный эффект на Км. Поскольку ингибитор связывается с комплексом субстрата и фермента, он эффективно уменьшает концентрацию этого комплекса, превращая часть его в тройнойEIS. По закону действующих масс это способствует смещению равновесия субстрат связывающей реакции вправо и тем самым ингибитор увеличивает количество субстрата, который связывается с ферментом, давая очевидное увеличение сродства фермента к субстрату и уменьшение Км.

Эффект на V_max Поскольку ингибитор не вытесняется большими количествами субстрата, а наоборот, при больших количествах субстрата быстрее идет образования его комплекса с ферментом, необходимого для проявления действия ингибитора и поэтому уменьшаетсяV_max.

Типичный график Лаинуивера — Берка для неконкурентного ингибитора представлен на рис. 2-12.

Вывод. Неконкурентные ингибиторы могут связываться только с комплексом субстрат-фермент, но не со свободным ферментом. В результате они не действуют при очень низких концентрациях субстрата. Они способствуют явному увеличению сродства фермента к субстрату, поскольку большее количество субстрата связывается с ферментом для образования, правда, неактивного тройного комплекса

Рис 2-12. График Лаинуивера-Берка для неконкурентных ингибиторов

Торможение продуктом реакции- пример конкурентного торможения.

Заключительный этап в действии любого фермента -выделение продукта. Это важный этап в работе фермента. Продукт связан с активным центром теми же связями, которые связывали и субстрат. Это взаимодействие похоже на субстрат связывающую реакцию, и подобно этой реакции, чаще всего является очень быстрой и легко обратимой. В результате этого, молекулы продукта способны к связыванию со свободным ферментом, образуя комплекс продукта и фермента. Как и в случае действия конкурентного ингибитора, продукт и субстрат пытаются занять активный центр, но не могут связываться одновременно. Поэтому предшествующее связывание продукта предохраняет фермент от связывания с субстратом , и продукт эффективно действует как ингибитор. В ферменте, катализирующем реакцию первого порядка это специализированная форма конкурентного торможения, поскольку субстрат и продукт конкурируют друг с другом. В ферментах с больше чем одним субстратом это выглядит более сложно.

В ферментных кинетических исследованиях мы почти всегда изучаем начальные скорости, которые является скоростью реакции, начинающейся немедленно после добавления фермента к субстрату. В это период времени, конечно, продукта нет, поскольку он еще не успел возникнуть, так что мы обычно игнорируем торможение продуктом в наших кинетических исследованиях.

Субстрат может быть ингибитором фермента

О бычно увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции фермента. Однако на некоторые ферменты большие количества субстрата могут оказывать противоположный эффект и фактически замедлять реакцию. Примером может служить инвертаза или- фруктофуранозидаза (КФ.3.2.1.26), который катализирует реакцию гидролиза

Рис 2-13. Влияние концентрации субстрата на скорость реакции

сахарозы на составляющие моносахариды глюкозу и фруктозу.

Предполагают, что причиной торможения может быть попытка двух молекул субстрата одновременно связаться с активным центром и пока молекулы субстрата связаны с активным центром фермент неактивен. Для такого связывания необходимо, чтобы вторая молекула субстрата «вставилась» в активный центр быстро вслед за первой, пока последняя не успела занять полноценную позицию для катализа. Поскольку столкновения между ферментом и субстратом полностью случайны, такое может случиться только при высоких концентрациях субстрата, когда частота случайных столкновений увеличивается, и явление торможения может быть замечено исследователем. Пример такого влияния показан на рис 2-13.

Т ак как торможение субстратом происходит при высоком уровне субстрата, начальная часть (низкая концентрация субстрата) этого графика идентична таковой для нормального

Рис 2-14. График Лаинуивера-Берка по данным рис 2-13.

фермента. При высоком уровне субстрата кривая снижается, что свидетельствует о торможении скорости реакции.

Так как фермент не следует предписаниям уравнения Михаэлиса и Ментен (не прямоугольная гипербола), график Лайнуивера Берка также не линеен. Поэтому вблизи оси 1/Vна участке высокой концентрации субстрата, линия изгибается вверх, указывая на снижение скорости. Продолжая линейную часть графика до пересечения с осями можно определить основные кинетические параметры обычным способом.

Табл 2- 5. Эффекты обратимых ингибиторов на кинетические константы

Конкурентный (Iсвязывается только кE)

Увеличение K_m_,аVmaxостается без изменений

Неконкурентный (Iсвязывается только сES)

Снижена VmaxиK_mОтношениеV_max.Kmостается без изменений

Смешанный неконкурентный (Iсвязывается сEилиES)

Активность фермента можно изменить путем ковалентной модификации его структуры.

Ковалентная модификация структуры ферментов может быть обратимой и необратимой.

А. Необратимые изменения активности фермента. Существует большое число реакций, катализируемых протеолитическими ферментами. Как правило, такие ферменты образуются в форме неактивных предшественников (проферментов), которые затем активируются путем действия других протеаз. Схеме активирования химотрипсина показана ниже на рис.2-15.

Рис 2-15. Схема протеолиза молекулы химотрипсиногена. Вначале под влиянием трипсина происходит отщепление полипептида из 15 аминокислот с образованием активного -химотрипсина, который путем аутокатализа превращается в-химотрипсин

Ниже в таблице приводятся примеры других ферментов, которые подвергаются активируются путем протеолиза

стенка клеток дрожжей

В качестве примера можно рассмотреть ферменты поджелудочной железы. Эти ферменты синтезируются в форме проферментов клетками поджелудочной железы и сохраняются в них в составе гранул проферментов. Высвобождение проферментов регулируется гормонами холецистокинином, панкрезимином и секретином. Усвоение белков требует скоординированного действия различных ферментов. Трипсиноген активируется энтеропептидазой выделяемой клетками щеточной каймы кишечника. Энтеропептидаза катализирует удаление гексапептида (Вал Асп Асп Асп Асп Лиз) от Nконца трипсиногена. Задача системы регуляции в данном случае обеспечить активирование фермента в месте его действия. Если активирование произойдет в месте синтеза, то это повлечет за собой разрушение самой железы (острый панкреатит). Небольшое количество энтеропептидазы, необходимое для активирования трипсиногена обеспечит последующее усиление (амплификацию) сигнала за счет образования больших количеств активного трипсина, который в свою очередь активирует другие протеазы кишечника. Такие цепные реакции усиления характерны для многих протеолитических систем организма (свертывание крови, система комплемента и т.д.) Процесс останавливается путем протеолиза самих ферментов Средняя ежедневная продукция короткоживущих гидролитических ферментов поджелудочной железой — около 10 г. Протеолитические ферменты широко распространены в клетках и это могло создать значительные проблемы, если бы не специальные белковые игибиторы, присутствующие в тканях и крови.

Б. Обратимые изменения активности фермента путем ковалентной модификации.

Фосфорилирование ферментов (рис 2-16) — одна из наиболее популярных реакций, позволяющая при присоединении остатка фосфорной кислоты изменить конформацию фермента и перевести фермент из активного состояние в неактивное или наоборот. Этот механизм ковалентной модификации обеспечивается киназами (присоединение остатков фосфорной кислоты за счет АТФ) и фосфатазами (гидролитическое удаление остатков фосфорной кислоты).

Более подробно об этих механизмах будет рассказано в разделах, посвященных механизму действия гормонов.

Рис 2-16. Обратимая ковалентная модификация путем фосфорилирования (киназа фосфорилазы) и дефосфорилирования (фосфатаза) фосфорилазы.

Регуляция активности с помощью гормонов.

Гормональная регуляция осуществляется на генетическом уровне путем обратного фосфорилирования. Например под действием адреналина и глюкагона происходит активация процесса распада гликогена, в ходе этого процесса образуется небелковое соединение — цАМФ, цАМФ — внутриклеточный гормон (вторичный посредник) яв-ся аллостерическим регулятором большого числа протеинкиназ. цАМФ образуется из АТФ под действием аденилатциклазы:

Гормон, циркулирующий в крови, попадает в межклеточную жидкость и контактирует с поверхностью клетки, где расположены рецепторы (Rs и Ri), белки узнающие и связывающие гормон.

Гормональный сигнал поступает на АЦ через белки посредники (Gs и Gi), которые активируются в условиях присоединения ГТФ. Уровень, образовавшийся под действием АЦ, цАМФ определяется не только активностью АЦ, но и активностью фосфодиэстераз, которые циклизируют цАМФ до АМФ.

Кроме цАМФ, существуют цГМФ, цУМФ, цЦМФ. Наибольшее значение имеет цГМФ. Она образуется под действием гуанилатциклазы, расположенной как в наружной мембране, так и внутри клетки, цГМФ единственный фермент, который реагирует на концентрацию Н₂О₂и активируется под действием продуктов перекисного окисления.

цГМФ оказывает эффекты противоположные цАМФ.

цАМФ находится в тесном контакте с ионами Ca 2+ : высокая концентрация цАМФ в возбудимых тканях приводит к высокой [Ca 2+ ] и стимуляции клетки. И наоборот, резкое уменьшение [Ca 2+ ] тормозит АЦ и снижает уровень цАМФ.

Изоферменты, их природа, биологическая роль, строение ЛДГ.

Изоферменты- это группа родственных ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию. Они происходят из одного предшественника за счет дупликациии гена с последующей мутацией образуемых аллелей. Они отличаются между собой:

1) скорстью катализа;

2) направлением катализируемой реакции;

3) условиями протекания реакции;

4) чувствительностью к регуляторам, факторам среды. (Более или менее устойчивы к ингибиторам);

5) сродством к субстрату;

6) особенностями структуры молекулы, ее ИЭТ, Mr, размерами и зарядом.

Изоферменты имеют адаптивное значение, т. е. придают специфику метаболизма.

Изоферменты обеспечивают межорганную связь, например, в процессе мышечной деятельности.

В миокарде и печени существуют различные изоферменты ЛДГ, которые обеспечивают метаболизм лактата:

в печени: ПВК ——> лактат

в сердце: лактат> ПВК

ЛДГ — олигомерный фермент, состоящий из 4-х субъединиц 2 типов.

H (heart) и M (muscle).

Существует 5 изоферментных форм:

HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM

H4 H3M H2M2 HM3 M4

ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5.

Поскольку H-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд, то изофермент H4 (ЛДГ1) будет мигрировать при электрофорезе с наибольшей скоростью к аноду.

С наименьшей скоростью к аноду будет двигаться М4.

Остальные изоферменты занимают промежуточное положение.

Изоферменты ЛДГ локализованы в различных тканях:

ЛДГ1,2 —-> мозг, аэробные ткани (миокард).

ЛДГ3 —-> лейкозные клетки.

ЛДГ4,5 —-> анэробные ткани: мышечная, скелетная.

Изоферменты появляются на различных этапах онтогенеза и реализуют программу индивидуального развития.

Изоферментный профиль меняется в процессе развития.

При патологиях имеется существенный изоферментный сдвиг.

Изменение активности ферментов в онтогенезе.

Изменение активности в онтогенезе.

Онтогенез человека развивается по определенной генетической программе, которая записана на уровне ткани, всего организма в гипоталамусе.

1. Внутриутробный период.

Характеризуется высокой активностью ферментов синтеза белка, липидов, происходит увеличение массы организма. Плод находится в анаэробных условиях и для метаболизма характерно анаэробная направленность.

Основной источник энергии — жирные кислоты, поступающие из организма матери; ЖК также выполняют строительную функцию (фосфолипиды мембран).

Глюкоза утилизируется анаэробным путем (анаэробный гликолиз), т. к. ткани плода не способны к ГНГ, и идет на развитие ЦНС.

2. Пренатальный период.

Характеризуется изменением активности ферментов, происходит подготовка организма к пребыванию в аэробной среде. Изменяется спектр гемоглобина, уменьшается его сродство к кислороду, изменяется активность митохондриальных ферментов.

Потребность в глюкозе резко возрастает, она начинает утилизироваться аэробно, но примерно до двух лет основным источником энергии является все же липиды, причиной чего является соматотропин. (Гормон роста).

4. Ранний дошкольный период.

С 3-х до 5-и лет. В этот период клетки начинают питаться углеводами. Происходит стабилизация обмена и интенсивная миелизация нервных волокон.

5. Школьный и пубертантный период.

Обмен веществ модулируется под действием половых гормонов.

Происходит стабилизация массы тела, репродуктивного гомеостаза. Послелет основным источником энергии являются опять липиды, что связано с ослаблением чувствительности тканей к Гл и изменение гормонального фона: гиперстресс (увеличивается уровень гормонов) заставляет клетку работать на пределе, т. е. использовать в качестве энергии жиры.

Заведующий кафедрой биологической химии, д.м.н., проф.

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Гомельский государственный медицинский университет»

Кафедра биологической химии

Обсуждено на заседании кафедры (МК или ЦУНМС)

ЛЕКЦИЯ по биологической химии

для студентов _2__ курсалечебногофакультета

Тема Ферменты 4. Номенклатура и классификация.

Учебные и воспитательные цели:

О локализации ферментов в клетке, органоспецифических и маркерных ферментах.

О качественном обнаружении и количественном определении активности. О единицах активности (МE, катал), удельной активности, числе оборотов ферментов.

О сопряженных ферментных системах и их применении. О номенклатуре, классификации ферментов (тривиальной, рациональной, систематической). О принципах классификации.